쥐 해마 뉴런을 배양하는 기술

초록

출처: Yang, R., et al. 축삭 초기 분절의 조립을 연구하기 위한 1차 배양 해마 뉴런 사용. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 쥐 해마에서 뉴런을 배양하는 방법을 보여줍니다. 처음에 해마는 세포외 조직 기질을 분해하기 위해 효소 소화를 거칩니다. 그 후, 소화된 조직은 개별 뉴런을 분리하기 위해 기계적으로 파괴됩니다. 마지막으로, 이러한 뉴런은 신경교세포(glial feeder cell)에서 배양됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 신경교세포 공급기 조리 (배양일 2주 전)

1. 출생 후 생후 1일 된 쥐의 뇌에서 피질을 해부하고 수막을 벗겨냅니다.
2. 깨끗한 벤치의 깨끗한 페트리 접시에 깨끗한 가위로 피질 조직을 최대한 잘게 자릅니다.
3. 다진 조직을 12mL의 HBSS로 옮기고 1.5mL의 2.5% 트립신과 1%(wt/vol) DNase를 첨가합니다. 37°C 수조에서 15분 동안 배양하고 5분마다 스윙합니다. 소화가 잘 되는 조직은 끈적끈적해져서 큰 덩어리를 형성합니다. 10mL 피펫으로 10-15회 분쇄하여 조직을 분해하고 더 잘 소화되도록 합니다.
4. 소화가 잘 되는 조직을 5mL 피펫으로 10-15회 분쇄하여 대부분의 덩어리가 사라지고 배지가 흐려질 때까지 합니다. 세포 여과기를 통과시켜 남아 있는 덩어리를 제거하고 15mL의 신경교세포배지(MEM)에 포도당(0.6% wt/vol), 10%(vol/vol) 말 혈청, 페니실린-스트렙토마이신(1x)을 첨가하여 소화를 멈춥니다.
5. 120 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 세포 펠릿을 세포 배양 접시(약 10⁵ cells/cm² )에 신선한 glia 배지 및 종자로 재현탁시킵니다.
6. 다음날 배지를 새로운 아교세포배지로 교체하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다.
7. 3-4일마다 신선한 신경교세포(glia) 접시에 신선한 신경교세포(glia) 배지를 공급하세요. 배지를 변경하기 전에 느슨하게 부착된 세포를 제거하기 위해 손으로 플라스크를 5-10회 두드립니다.
8. 배양 10일 후에는 신경교세포가 거의 융합되어야 합니다. 0.25% 트립신-EDTA로 신경교세포를 분리하고 새로운 60mm 세포 배양 접시에 약 10개의⁵개 세포를 파종합니다. 나머지 세포는 나중에 사용하기 위해 동결 할 수 있습니다.
9. 배양일 3일 전에 신경교세포배지를 신경세포 배양배지로 변경(GlutaMAX-I 1개 및 B27 보충제 1개가 포함된 Neurobasal-A 배지)

2. 문화 해마 뉴런

참고: 모든 단계는 실온에서 수행됩니다.

1. ANK3-E3/23f/f 마우스의 출생 후 1일 된 새끼에서 6-8마리의 하마를 실온의 페트리 접시에 넣어 HBSS 배지로 해부합니다. 해부 가위로 해마를 더 작은 조각으로 자릅니다. 페트리 접시에서 해마를 15mL 튜브로 옮깁니다.
2. 튜브에 HBSS 5mL로 해마를 2x 세척합니다. 세척 후 4.5mL의 1x HBSS에 해마를 그대로 두십시오.
3. 2.5% 트립신 0.5mL를 HBSS 4.5mL에 넣고 37°C 수조에서 15분 동안 배양합니다. 5분마다 튜브를 뒤집습니다. 소화가 잘 되는 해마는 끈적끈적해져서 군집을 형성해야 합니다. 필요한 경우 소화를 5분 더 연장합니다.
4. HBSS로 해마를 각각 5분씩 3회 씻습니다. HBSS를 제거하기 위해 진공 청소기를 사용하지 마십시오. 해마를 제거하는 것은 매우 쉽습니다.
5. 세척 후 HBSS 2mL를 추가하고 파스퇴르 피펫으로 해마를 위아래로 15회 피펫팅합니다.
6. 불에 닦인 파스퇴르 피펫(개구부의 직경이 절반으로 좁아짐)으로 조직을 10회 분쇄합니다. 아직 덩어리가 남아 있어도 10회를 넘지 마십시오. 과전단은 뉴런을 죽입니다.
7. 모든 덩어리가 바닥에 굳을 때까지 튜브를 5분 동안 쉬게 합니다. 1mL 피펫 팁을 사용하여 해리된 뉴런을 포함하는 상등액을 도금 접시(10,⁵세포/60mm 접시)로 부드럽게 옮깁니다. 사전 배양된 도금 매체에 직접 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔듭니다.
8. 대부분의 청크가 사라질 때까지 나머지 청크에 대해 2.6-2.7단계를 반복합니다.
9. 파종 후 2-4 시간, 광학 현미경으로 도금 접시를 확인하십시오. 대부분의 뉴런은 커버슬립에 부착되어야 합니다. 부착된 세포는 둥글고 밝습니다. 왁스 점 면이 아래를 향하도록 미리 조절된 신경 세포 배양 배지가 있는 신경교세포 공급기 접시에 미세한 팁 집게를 사용하여 커버슬립을 뒤집습니다.
10. 뉴런은 신경교세포 공급기 접시에서 최대 1개월 동안 자랄 수 있습니다. 7일마다 뉴런에 1mL의 신선한 뉴런 배양 배지를 공급합니다.
11. 선택 단계: 파종 1주일 후 시토신 아라비노사이드(1-β-D-아라비노푸라노실시토신)를 최종 농도 5μM까지 첨가하여 신경교세포 증식을 억제합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10배HBSS	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제14065-056
18mm 커버 글래스(1.5D)	피셔 사이언티픽	12-545-84-1일
2.5% 페놀이 없는 트립신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제14065-056
ANK3-E22/23F/F 마우스	잭스	재고번호: 029797
폴리-L-라이신 염산염	시그마-알드리치	26124-78-7
B27 무혈청 보충제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A3582801
DMEM을 참조하십시오.	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11995073
GlutaMAX-I 보충제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A1286001
리포펙타민 2000	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11668030
Earle's salts와 L-glutamine을 함유한 MEM	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제11095-080
Neurobasal 배지	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제21103-049
D-포도당	시그마-알드리치	G7021
페니실린-스트렙토마이신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15140122

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