Generating a low-density primary neuroron culture from frozen embryonic neurons (동결된 배아 뉴런에서 저밀도 1차 뉴런 배양 생성)

초록

출처: Koganezawa, N. et al., 배아 해마 뉴런의 냉동 재고를 사용한 쉽고 재현 가능한 저밀도 1차 배양.J. Vis. 특급 (2023)

이 비디오는 제어된 해동, neurobasal 배지로 희석, poly-L-lysine 코팅된 플레이트에 파종하는 것을 포함하여 냉동 보존된 배아 뉴런을 배양하는 방법을 보여줍니다. 후속 배양은 신경 세포의 성장과 유지를 지원합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 플레이트 코팅

1. 96웰 마이크로플레이트를 폴리-L-라이신(1mg/mL, 0.1M 붕산염 완충액[pH: 8.5]에 희석, 100μL/웰)으로 코팅하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   메모: 사용해야 하는 우물만 코팅하십시오. 여기에서 수행 된 실험에서는 중간 60 개의 우물이 사용됩니다. 붕산염 완충액은 멸균된 물에 50mM 붕산과 12mM 붕산염을 혼합하여 제조됩니다.
2. 멸균수(250μL/well)로 플레이트를 두 번 세척합니다.
3. 보충제 없이 신선한 배양 배지(250μL/well)로 플레이트를 한 번 세척합니다.
4. 깨끗한 벤치에서 접시를 20분 동안 말리십시오.
5. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 사용할 때까지 4°C로 유지합니다(1개월 동안 유효).

2. 세포 파종

1. 코팅된 플레이트에 배양 배지 50μL/웰을 추가하고 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에 30분에서 1시간 동안 보관합니다. 주변 웰에 멸균된 물(200μL/웰)을 채웁니다.
   메모: 배양 배지는 neurobasal 배지에 50x B-27, 400x Glutamax 및 100 U/mL의 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 제조됩니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
2. 액체 질소 탱크에서 뉴런 cryovial을 제거합니다. 여기에 사용된 뉴런은 디메틸 설폭사이드-냉동 보존(DMSO-cryopreserved) 뉴런이었습니다.
3. 극저온을 37°C 가열 블록에 최대 3분 동안 담그고 내용물을 부분적으로 해동합니다. 극저온을 너무 오래 예열하지 마십시오. 해동되는 즉시 내용물을 50mL 튜브에 옮깁니다.
4. 팁이 넓은 공극이 있는 1mL 피펫을 사용하여 뉴런 냉동 내용물을 멸균 50mL 튜브에 적가(50μL/s) 천천히 옮깁니다.
5. 빈 cryovial을 1mL의 배양 배지(실온; RT)를 사용합니다. 이 1mL의 배양 배지를 cryovial 적하(50 μL/s)에서 세포 현탁액이 들어 있는 50mL 튜브로 옮깁니다.
6. 50mL 튜브에 9mL의 배양 배지(RT)를 적가(0.5mL/s)하고 부피를 11mL로 구성합니다. 피펫팅을 반복하지 말고 세포 현탁액을 천천히 혼합하십시오.
7. 세포 수를 계산합니다(세포 계수기 또는 혈구계 사용).
8. 모든 세포 현탁액을 저장소로 옮기고 기공이 넓은 팁(1.0 x 10,⁴ cells/well)이 있는 다중 채널 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 96웰 플레이트로 분주합니다. 배양 배지 증발을 줄이려면 주변 웰에 멸균된 물을 채웁니다(2.1단계).
   메모: 이 연구는 배지 교환이 없는 3주 배양에 대해 배양 배지 증발이 적다는 것을 확인합니다. 매체의 환원율은 3.6%(n = 120웰)입니다. 따라서 3주간의 잠복기 동안 삼투압 변화는 급격하지 않습니다.
9. 37 ° C, 5 % CO₂ 인큐베이터에서 1-2 시간 동안 뉴런을 배양합니다.
10. 배양 배지를 웰당 100μL의 예열된 배양 배지(37°C)로 교체하고 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에 다시 넣습니다(배양 중 배지 변경이 필요하지 않음).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 플레이트	지온 코퍼레이션		재능 있는
96웰 플레이트	그라이너	655986
나-27	지브코	제17504-044	MEA 플레이트의 경우 2 V/V%, 일반 플레이트의 경우 50x
붕 사	시그마	나-9876	최종 농도 12 mM
붕산	와코	제021-02195	최종 농도 50 mM
소 혈청 알부민	밀리포어	12659-100지	최종 농도: PBS에서 3%
글루타맥스	지브코	제35050-061	MEA 플레이트의 경우 2.5mM, 일반 플레이트의 경우 400배
셀 분석기 2200	싸이티바		형광 이미지
뉴로기저	지브코	제21103-049
페니실린/스트렙토마이신	지브코	15140-122	일반 플레이트의 경우 100 U/mL
페니실린/스트렙토마이신	나칼라이 테스크	26253-84	MEA 플레이트의 경우 100μg/mL
폴리-L-라이신	시그마	P2636	붕산염 완충액에 희석됨(최종 농도: 1mg/mL)
SKY 뉴런	알츠메드 , Inc.	아르H001	1.0 x 106 셀/튜브

호 호 호 호 년 년 (영문)