검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. Poly-L-lysine으로 코팅 유리 커버 슬립
- 200μg/mL 폴리-L-라이신(PLL) 용액의 분취액 5mL를 해동하여 유리 커버슬립을 준비합니다. 45mL의 순수 주입 등급 물을 첨가하여 이 원액을 20μg/mL로 희석합니다. 용액을 새로운 50mL 코니컬 튜브로 필터 멸균합니다. 이 튜브를 "PLL Sterile"으로 표시합니다.
메모: 해동 속도를 높이기 위해 실온에 보관된 물을 사용하십시오.
- 멸균 PLL 용액에 100개의 멸균, 원형, 12mm 유리 커버슬립을 추가합니다. 균일한 코팅을 위해 5-10분마다 2-3분 동안 튜브를 교반합니다. 이런 식으로 커버 슬립을 1 시간 동안 코팅하십시오 .
메모: 독일에서 제조된 원형 유리 커버슬립(직경 = 12mm)은 신뢰할 수 있는 배양 표면을 제공하고 24웰 세포 배양 플레이트의 웰에 쉽게 맞기 때문에 선호됩니다.
- PLL 코팅 40분 후 티슈 페이퍼 2장을 가져다가 플로우 캐비닛에 평평하게 놓습니다. 70% 에탄올을 사용하여 종이를 살균한 다음 평평하게 펴서 주름을 제거하고 건조시킵니다.
- 유리 커버슬립을 PLL로 1시간 동안 코팅한 후 과도한 PLL 용액을 제거하고 멸균 주입 등급의 물을 추가합니다. 과도한 PLL을 제거할 수 있도록 커버슬립을 2-3초 동안 부드럽게 저어줍니다. 이 헹굼 단계를 2회 더 반복합니다.
- 여분의 물을 제거한 다음 커버 슬립을 멸균 티슈 페이퍼로 옮깁니다. 구부러진 집게를 사용하여 각 커버슬립을 조심스럽게 분리하고 건조시킵니다.
메모: 쉽게 분리되지 않는 커버슬립은 버릴 수 있습니다. 또는 분리를 돕기 위해 소량의 물을 추가할 수 있습니다.
- 건조되면 커버슬립을 24웰 배양 플레이트로 옮깁니다.
메모: 커버슬립은 해부 과정을 시작하기 약 30분-1시간 전에 준비해야 합니다. 플레이트는 필요할 때까지 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터에 보관할 수 있습니다.
2. 해마와 피질 조직의 해리
- 세포 배양 용액의 준비
- 신경 조직의 해리를 위해 먼저 세포 배양 완충액 40mL 분취액(조성[mM]: 116 NaCl, 5.4 KCl, 26 NaHCO3, 1.3 NaH2PO4, 1 MgSO4·7H2O, 1 CaCl2·2H2O, 0.5 EDTA·2Na·2H2O 및 25 D-포도당)을 해동하고, pH = 7.4)입니다. 12mL의 세포 배양 완충액을 15mL 원뿔형 튜브에 측정합니다. 레이블을 "BSA"로 표시합니다. 5mL의 세포 배양 완충액을 다른 15mL 튜브로 측정합니다. 라벨을 "파파인"으로 지정합니다. 두 튜브를 모두 37°C에서 15분 동안 수조에서 배양합니다.
- 남은 세포 배양 완충액을 필터 멸균하고 "완충액 - 멸균"으로 표시한 후 필요할 때까지 4°C에서 보관합니다.
- 120mg의 소 혈청 알부민(BSA)의 무게를 잰 후 "BSA"라고 표시된 튜브에 넣습니다. 파파인 7mg의 무게를 잰 후 "파파인"이라고 표시된 튜브에 넣습니다. 두 튜브를 모두 수조에 15분 동안 다시 넣습니다.
메모: 파파인 분말의 이송을 용이하게 하기 위해 계량 보트에 소량의 완충액을 추가하는 것이 도움이 됩니다.
- 모든 분말이 용해되면 각 용액을 새 15mL 원뿔형 튜브에 필터 멸균합니다. 튜브 파파인의 경우 여과된 용액에 "파파인 - 멸균"이라는 라벨을 붙입니다. 튜브 BSA의 경우, 멸균 BSA 용액을 각각 4mL의 BSA 용액이 들어 있는 3개의 튜브로 나눕니다. 각 튜브를 "BSA - Sterile"과 "1", "2" 또는 "3"으로 표시합니다. 모든 튜브를 수조로 다시 넣고 필요할 때까지 37°C에서 계속 배양합니다.
- 조직 해부를 위한 준비
- 35mm 여과지 한 장(재료 표 참조)을 가져다가 70% 에탄올로 살균합니다. 플로우 캐비닛의 100mm 페트리 접시 뚜껑에서 건조시킵니다. 해마와 피질을 해부하는 데 필요한 가위, 집게, 메스 및 주걱(재료 표 참조)을 배치합니다.
- 멸균 여과지가 들어 있는 35mm 페트리 접시 두 개와 100mm 페트리 접시를 흐름 캐비닛 중앙의 접근 가능한 위치에 놓습니다.
- 형질전환 NexCre를 수집합니다. Ai9 및 VGAT 금성 새끼 쥐를 해부할 예정입니다. 적절한 여기 및 방출 필터(재료 표 참조)가 있는 형광등을 사용하여 형광 새끼와 야생형 새끼를 구별하십시오.
- 동물을 해부하기 직전에 각 35mm 페트리 접시에 냉장 멸균 세포 배양 완충액을 채웁니다.
메모: 하나의 페트리 접시는 해부 사이의 도구를 청소하기 위한 것이고, 다른 하나는 해마와 피질을 모으기 위한 것입니다.
- 조직 해부
- 세포 배양 완충액을 붓자마자 크고 날카로운 가위를 사용하여 출생 후 0-2일 형질전환 마우스 또는 새끼 쥐의 목을 베고 멸균 100mm 페트리 접시를 사용하여 머리를 흐름 캐비닛으로 옮깁니다. 집게, 가위, 주걱을 사용하여 형질전환 강아지의 뇌를 멸균 여과지로 조심스럽게 옮깁니다.
- 유형 22 메스를 사용하여 소뇌를 절개하고 2개의 반구를 분리합니다. 작은 주걱을 사용하여 반구를 옆으로 굴립니다. 각 반구에서 피질이 여과지와 접촉하도록 부드럽게 누릅니다. 해마와 피질이 드러나도록 중뇌 영역을 부드럽게 움직입니다.
메모: 반구를 눌렀을 때 너무 많은 압력을 가하거나 세포가 부서질 수 있으므로 주의하십시오.
- 메스나 주걱을 사용하여 각 반구에서 해마와 피질을 분리합니다. 절개된 조직을 냉각된 세포 배양 완충액이 들어 있는 35mm 페트리 접시로 옮깁니다.
메모: 여러 동물을 해부하는 경우 멸균 세포 배양 완충액을 얼음 위의 50mL 원뿔형 튜브에 보관하십시오. 각 해부 후 절개된 조직을 냉각된 세포 배양 완충액으로 옮깁니다.
- 피질-해마 조직을 성공적으로 해부한 후 멸균 파파인 용액을 수조에서 흐름 캐비닛으로 옮깁니다. 3mL 파스퇴르 피펫을 사용하여 절개된 해마와 피질을 멸균된 35mm 페트리 접시의 뚜껑으로 옮깁니다. 조직이 작은 조각이 될 때까지 유형 22 메스의 평평한 부분을 사용하여 십자형으로 자릅니다.
- 소량의 파파인 용액을 사용하여 페트리 접시 뚜껑에서 다진 조직을 멸균 파파인 튜브로 옮깁니다. 파파인 튜브를 수조에 다시 넣고 37°C에서 25분 동안 조직을 배양합니다.
- 파파인 배양 중에는 완전한 형광 배지 용액을 구성합니다. B27 분취액 1mL, 글루타맥스 분취량 0.5mL, 펜-스트렙 분취량 0.5mL를 해동합니다. 48.5 mL의 동면 표본 저형광 매체를 50 mL 코니컬 튜브에 분배합니다. 용액에 B27, Glutamax 및 Pen-Strep을 첨가합니다. 용액을 잘 흔든 다음 여과 살균하고 "Hibernate A complete media"(날짜 및 이니셜 포함)로 표시합니다. 37 °C의 수조에서 배양합니다.
- 파파인 배양 후 파파인 튜브와 멸균 BSA 튜브를 flow cabinet으로 옮깁니다. 1mL 파스퇴르 피펫을 사용하여 파파인 튜브에서 피질 해마 조직만 BSA 튜브 1.
로 제거합니다.
메모: 과도한 파파인 용액의 전달을 최소화하도록 주의하십시오.
- 세포의 해리
- 큰 조직 덩어리를 분해하려면 1mL 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 여러 번 분쇄합니다. 그런 다음 미세한 팁 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 7 번 분쇄합니다. 조직을 30초 동안 그대로 두어 더 큰 조직 조각이 침전될 수 있도록 합니다.
- 30초 후, 하단 1mL의 용액과 조직을 BSA-튜브 1에서 BSA-튜브 2로 옮깁니다. 미세한 팁 파스퇴르 피펫을 사용하여 BSA-tube 2의 조직을 여러 번 Triturate합니다.
- 분쇄 후 BSA 튜브 1에서 아래쪽 1mL의 조직과 용액을 다시 옮기지만 이번에는 BSA 튜브 3으로 옮깁니다. 미세한 팁 파스퇴르 피펫을 사용하여 BSA 튜브 3의 조직을 여러 번 Triturate합니다.
- 분쇄 후 튜브 2와 3의 모든 용액과 조직을 BSA 튜브 1로 옮깁니다. 2-3회 더 분쇄하고 3,000 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 원심분리 중에는 완전한 신경 기저 A 배지(NBA 배지)를 구성합니다. 48.5mL의 NBA 배지를 50mL 코니컬 튜브에 부분 표본으로 추출하고 수조에서 37°C로 배양합니다. 이 튜브에 "NBA 전용"이라는 레이블을 지정합니다. 또한 B27 분취 1mL, 글루타맥스 분취 0.5mL 및 Pen-Strep 분취 0.5mL를 실온에서 해동합니다.
- 원심분리 후 펠릿 조직에서 상층액을 조심스럽게 제거하고 2mL의 완전한 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. P1000 피펫을 사용하여 조직을 위아래로 20회 분쇄합니다.
메모: 세포를 너무 세게 피펫팅하지 않도록 주의하십시오. 너무 많은 압력이 가해지면 세포가 손상될 수 있습니다.
- 1mL 파스퇴르 피펫을 사용하여 30μm 세포 체를 통해 세포 현탁액을 폴리스티렌 샘플 튜브로 여과합니다.
메모: 세포 현탁액이 세포 체를 즉시 통과하지 않으면 멸균 장갑으로 체 상단을 눌러 흐름을 시작해야 할 수 있습니다. 이 중요한 단계는 세포 분류기의 막힘을 방지합니다.
- 분류 후 뉴런을 수집하려면 300μL의 완전한 배지를 필요한 수의 폴리프로필렌 튜브에 피펫팅하여 수집 튜브를 준비합니다.
- 이제 세포 현탁액을 선별을 위해 세포 분류기로 가져갈 준비가 되었습니다. 세포 현탁액, 추가 수집 튜브 및 시료 희석이 필요한 경우를 대비하여 예비 전체 배지를 준비합니다.
3. 정제된 GABAergic 또는 글루타메이터 뉴런의 세포 분류
참고: 분류 중 박테리아 오염 가능성을 최소화하려면 분류기 s를 헹굽니다.amp분류하기 전에 최소 50분 동안 분류기의 튜브 튜브를 5% 에탄올로 세척하십시오. 자세한 정렬 매개변수는 기기마다 다르며 기본 고려 사항은 다음과 같습니다.
- 첫 번째 세포 분류 동안, 야생형 동물의 세포를 분류하고 비교하여 표지되지 않은 세포로부터 배경 형광 수준을 확립합니다.
- 분류할 각 형광 세포 유형에 대해 적절한 excitation 및 emission filter를 선택합니다. Venus 및 TdTomato 단백질을 각각 488nm 또는 531nm 여기 파장을 사용하여 여기합니다. 각각 530/40 및 575/30 방출 필터 세트를 통해 방출된 빛을 감지합니다.
- 세포 채취를 위해 300μL의 완전한 배지를 포함하는 폴리프로필렌 수집 튜브를 세포 분류기에 추가합니다.
- 고순도의 경우, 밝게 라벨링된 형광 세포를 분류합니다(예: 분류된 세포의 점도표는 그림 1B 참조).
- 정렬 후 최적의 결과를 얻으려면 정렬된 세포의 순도 테스트를 수행하여 순도 수준을 추정합니다. 정렬 후 세포의 일반적인 회수율은 70-80%입니다.
- 각 수집 튜브에 정렬된 세포의 수를 기록해 둡니다. 이 값은 세포 분류 기기에 의해 제공됩니다.
메모: 세포 분류는 70μm 노즐(70psi sheath 유체 압력) 또는 100μm 노즐(20psi sheath 유체 압력)을 사용하여 수행할 수 있습니다.
4. 정렬된 뉴런의 배양
- 세포 분류 후 1mL 파스퇴르 피펫을 사용하여 수집된 세포를 2mL 둥근 바닥 원심분리 튜브로 옮깁니다. 3,000 x g에서 3분 동안 세포를 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다.
메모: 세포 펠릿의 위치를 식별하는 데 도움이 되도록 뚜껑의 힌지가 바깥쪽을 향하도록 둥근 바닥 원심분리기 튜브를 향하게 하여 세포 펠릿이 원심분리기 튜브 뒷면(즉, 힌지와 튜브의 같은 쪽)에 형성될 수 있도록 합니다.
- 원심분리 중에 예열된 NBA 배지 48.5mL에 B27 1mL, 글루타맥스 0.5mL, Pen-Strep 0.5mL를 추가합니다. 용액을 잘 흔든 다음 여과, 살균 및 "NBA complete media"(날짜 및 이니셜 포함)로 표시합니다. 필요할 때까지 수조로 돌아가십시오.
- 원심분리 후 1mL 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 다른 원심분리 튜브로 옮깁니다(세포 펠릿이 교란된 경우 상층액을 보관). 1,000 cells/μL의 세포 밀도를 달성하기 위해 필요한 양의 예열된 완전한 NBA 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. P200 또는 P1000 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 세포를 다시 현탁합니다.
- 해리된 세포의 존재를 확인하려면 4x 또는 10x 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 세포 용액을 확인하십시오. 또는 소량의 세포 용액을 커버슬립에 피펫으로 넣고 현미경으로 확인합니다. 많은 수의 세포가 존재하는 경우 4.3단계의 상등액을 버릴 수 있습니다.
- 세포를 도금하기 전에 균일한 세포 현탁액을 보장하기 위해 2-3초 동안 중간 속도로 와류를 치십시오. 볼텍싱(vortexing) 후 세포 현탁액 10μL를 각 커버슬립의 중앙으로 빠르게 피펫팅합니다. 세포를 피펫팅한 후 각 플레이트를 신속하게 인큐베이터(5% CO2/37 °C)로 되돌리고 1시간 동안 배양
메모: 여러 개의 24-well 플레이트에 세포를 추가하는 경우, 플레이트 사이의 세포를 와류로 처리하여 균일한 세포 밀도를 보장합니다.
- 1시간 후, 예열된 완전한 NBA 배지 500μL를 세포에 공급하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
메모: 세포에 공급될 때 세포 분리를 방지하기 위해 웰 측면 아래로 배지를 부드럽게 피펫팅하는 것이 중요합니다. 짧은 실험(<16일)의 경우 위의 밀도에서 먹이를 줄 필요가 없습니다. 더 높은 밀도의 세포를 도금할 때 더 빈번한 공급 간격이 필요할 수 있습니다.
