Generating Neural progenitors from Embryonic Stem Cells in Serum-Free Monolayer Cultures(무혈청 단층 배양에서 배아 줄기 세포로부터 신경 전구체 생성)

초록

출처: Wongpaiboonwattana, W., et al. Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture(혈청이 없는 단층 배양에서 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화) Exp.(2015년)

이 비디오는 무혈청 배지를 사용하여 마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다. 무혈청 배지에 현탁된 배아 줄기 세포의 원하는 농도는 젤라틴으로 코팅된 커버슬립에 도금됩니다. 최적의 세포 밀도에서 세포는 자가분비 신호 인자를 생성하고, 이 인자는 무혈청 배지의 신경 분화 유도 인자와 함께 배아 줄기 세포가 신경 전구세포로 분화되도록 촉발합니다.

프로토콜

1. 미디어 준비

참고: 이 프로토콜은 변형된 N2 보충제로 보충된 DMEM/F12와 B27 보충제로 보충된 Neurobasal의 두 가지 개별 매체를 일반적으로 1:1 비율로 혼합하여 사용하는 데 의존합니다.

1. 15ml 튜브에 성분을 혼합하여 변형된 N2 보충제를 준비합니다. 이것을 소용돌이치거나 필터링하지 마십시오. 용액이 투명해질 때까지 튜브를 뒤집어 혼합합니다.
   1. DMEM/F12 7.2ml를 피펫팅한 다음 25mg/ml 인슐린(0.01M HCl로 구성) 1ml를 넣고 튜브를 뒤집어 잘 섞습니다. 솔루션이 명확해질 때까지 몇 분 정도 걸립니다.
   2. 100 mg/ml 아포-트랜스페린 1 ml(물에 함유), 0.6 mg/ml 프로게스테르논 33 μl(에탄올에 함유), 160 mg/ml(1 M) 푸트레신(1 M) 푸트레신(100 μl), 3 mM 아셀렌산나트륨 10 μl(물에 함유) 및 7.5% 소 혈청 알부민 666 μl를 넣고 튜브를 잘 섞는다. 2.5ml로 분주하고 -20 °C에서 최대 2 개월 동안 보관하십시오.
2. 미디어를 준비합니다.
   1. DMEM/F12 250ml에 N2 2.5ml를 추가합니다. 잘 섞되 흔들거나 걸러내지 마십시오.
   2. Neurobasal 배지 250ml에 B27 보충제 5ml를 첨가합니다. 잘 섞되 흔들거나 걸러내지 마십시오.
   3. 1.2.1 및 1.2.2 단계의 미디어를 1:1 비율로 혼합합니다. 경우에 따라 1:3 혼합이 필요할 수 있습니다(1.2.4단계에서 1:1 혼합으로 추가됨).
   4. 혼합물에 L-글루타민 0.5ml(최종 농도 0.2mM)와 2-메르캅토에탄올 3.5μl(최종 농도 0.1mM)를 넣고 흔들지 않고 잘 섞습니다. 미디어를 4°C에서 최대 3주 동안 보관하고 빛에 노출시키지 마십시오. 이 최종 믹스를 N2B27이라고 합니다.
3. 젤라틴 용액을 준비합니다.
   1. 초순수에 1% 젤라틴 용액을 준비하고 121°C, 15psi에서 15분 동안 오토클레이브합니다. 이를 위해 사용되는 병은 세제나 소독제로부터 완전히 깨끗한 것이 중요하므로 이를 위해 새 병을 사용하는 것이 좋으며 사용 사이에는 초순수로만 헹굽니다. 1% 용액을 50ml 분취액에 나누고 4°C에서 수개월간 보관합니다.
   2. 1% 젤라틴의 분취액을 37°C 수조에서 녹을 때까지 데우고 따뜻한 인산염 완충 식염수(PBS) 500ml를 추가합니다. 잘 섞고 각 웰 또는 플레이트의 바닥을 덮을 만큼 충분히 피펫을 피펫합니다. 젤라틴이 최소 30분 동안 표면을 코팅하도록 합니다.

2. 셀 도금

참고: 이 프로토콜은 백혈병 억제 인자(LIF)가 있는 10% 혈청에서 성장한 쥐 배아줄기세포, LIF로 혈청을 대체하거나 LIF와 골형태유전단백질4(BMP4) 또는 LIF가 있거나 없는 MEK 및 GSK3 억제제(2i 배지)로 혈청이 없는 배아줄기세포에 동일하게 적용됩니다. 그러나, 분화의 시기와 효율은 배지 및 세포에 따라 달라질 수 있다. 여기에 표시된 실험을 위해 10% 혈청과 LIF로 GMEM에서 성장한 46C 마우스 ESC 라인(EGFP 리포터가 내인성 Sox1 대립유전자 중 하나에 노크됨)을 사용했습니다. 최적의 결과를 얻으려면 세포를 N2B27 배지에서 해리하고 재도금하는 것이 중요합니다. 단순히 배지를 GMEM/혈청/LIF에서 N2B27로 변경하는 것만으로도 세포를 재도금하는 것에 비해 항상 분화 효율이 떨어집니다.

1. GMEM에서 10% 혈청, 1mM 피루브산 나트륨, 비필수 아미노산 1개, 0.1M 2-메르캅토에탄올 및 100 units/ml LIF13으로 세포를 성장시킵니다. 마우스 ESC의 subconfluent 배양을 얻으려면 1 x 10⁶ 세포를 T25 배양 플라스크에 플레이트화하며 2 - 3일이 소요됩니다.
2. 명시야 현미경으로 세포를 관찰합니다. 세포가 subconfluent 되고 통과할 준비가 되면 PBS에서 두 번 헹굽니다. 세포 해리 시약 1ml를 넣고 2 - 5분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 트립신 및 기타 효소도 세포 해리에 사용할 수 있지만 세포 부착에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 도금 밀도를 조정해야 합니다.
3. 세포가 플레이트에서 들어 올려지기 시작하면 혈관을 두드려 단일 세포 현탁액으로 제거합니다. 세포를 10ml의 배지 및 세포 해리 시약에 넣고 15ml 원심분리 튜브에 피펫을 넣습니다.
4. RT에서 3분 동안 300 x g에서 셀을 회전시킵니다.
5. 상등액을 조심스럽게 흡인하고 예열된 N2B27 10ml에 펠릿을 위아래로 3-5회 피펫팅하여 다시 현탁시킵니다. 서스펜션을 아래로 피펫팅할 때 기포가 생성되지 않도록 튜브 측면에 피펫을 대고 피펫을 합니다. 자동 세포 계수기 또는 혈구계로 세포를 계수하고 농도를 기록합니다.
6. 예열된 N2B27에서 웰당 도말할 부피 단위당 원하는 수의 세포를 포함하는 세포 현탁액을 준비합니다. 6웰 접시에서 cm²당 10,500개의 세포 밀도(즉, 6웰 접시의 웰당 1 x 10⁵ 세포)가 최적입니다. cm당 제안된 세포 수² 및 다양한 세포 배양 용기에 대한 도금 배지 부피는 표 1 을 참조하십시오.
7. 배양 용기에서 젤라틴을 흡인하고 표 1에서 제안한 밀도와 부피에 따라 세포 현탁액을 플레이트에 넣습니다. 플레이트를 소용돌이치지 마십시오, 이렇게 하면 세포가 중앙으로 집중됩니다. 배양물을 37°C, 5% CO₂의 습한 인큐베이터에 넣습니다.
8. 1 - 2일마다 모든 미디어를 새 N2B27로 교체하여 미디어를 교체하십시오. 세포를 세척하는 것처럼 부드럽게 피펫을 투여하면 밀도에 영향을 미치고 다음 날에 분화 효율이 감소할 수 있습니다. 도금 후 초기 생존율이 좋지 않은 경우, N2 및 B27이 보충된 배지를 1:3 비율로 혼합하여 세포를 플레이트화하고 처음 2일 후에 이를 N2B27로 변경합니다. 세포는 분화를 시작하고 4-6일 이내에 Sox1 발현(여기에 사용된 46C 세포주에서 리포터의 녹색 형광으로 볼 수 있음)을 보여야 합니다.

표 1. 다양한 용기 크기에 대해 제안된 도금 밀도 및 매체 부피. 이 표의 도금 밀도는 46C 세포주를 사용하여 측정되었습니다. 최적의 결과를 얻으려면 각 개별 라인의 도금 밀도를 조정해야 할 수 있습니다.

플랫폼	유효 밀도 범위(세포/cm2)	플레이트할 셀 번호의 범위	권장 초기 배지 부피(μl)	1일차 이후 권장 배지 볼륨(μl)
6웰 플레이트	10,500 - 36,500	99,750 - 346,750	1,000	2,000
24웰 플레이트	15,600 - 46,800	29,640 - 88,920	500	1,000
96웰 플레이트	103,500 - 260,000	33,120 - 83,200	100	200

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 태아 세럼	생명 기술	10270-106
DMEM/F12	생명 기술	제11320-074
Neurobasal 배지	생명 기술	제21103-049
StemPro Accutase 세포 해리 시약	생명 기술	A11105-01
B-27 보충제, 무혈청	생명 기술	제17504-044
인슐린	시그마	I6634	멸균 0.01M HCl로 재구성
아포 트랜스페린	시그마	T1147	멸균수로 재구성
프로게스테론	시그마	P8783	에탄올로 재구성
푸트레신	시그마	P5780	멸균수로 재구성
아셀렌산나트륨	시그마	S5261 (영어	멸균수로 재구성
소 알부민 분획 V	생명 기술	제15260-037
L-글루타민	생명 기술	제25030-081	글루타민은 일반적으로 침전되므로 사용하기 전에 완전히 용해되었는지 확인하십시오.
젤라틴	시그마	G1890
6웰 조직 배양 접시	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	140675
24웰 조직 배양 접시	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	142475
96웰 조직 배양 접시	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	167008
지맘	생명 기술	제11710-035
소 태아 세럼	생명 기술	10270-106
MEM 비필수 아미노산 용액	생명 기술	제11140-050
나트륨 피루브산	생명 기술	제11360-070
2-메르캅토에탄올	시그마	M7522
25cm2 조직 배양 플라스크	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	156367

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