다공성 스캐폴드를 사용하여 인간 신경 줄기 세포를 3D 배양으로 분화

초록

출처: Stevanato, L. et al., 3차원 배양에서 인간 신경 줄기 세포주의 분화, MicroRNA 및 추정 대상 유전자 분석. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 3차원 골격 내에서 인간 신경 줄기 세포의 발달과 분화를 보여줍니다. 골격의 라미닌 코팅은 세포 부착을 촉진하고, 성장 인자를 사용하지 않는 신경 매질은 세포가 신경 전구 세포로 분화되도록 유도하여 다공성 구조 내에서 여러 방향으로 프로세스를 확장하여 3차원 배양을 형성합니다

프로토콜

1. 3차원(3D) 문화에 대한 HNSC 차별화

참고: 이전 간행물에 기술된 윤리적으로 승인된 조직에서 인간 신경 줄기 세포(hNSC)를 분리하고 파생합니다. 이 절차를 따르는 동안 윤리적 및 제도적 지침을 따르십시오.

1. 12웰 플레이트를 사용한 3D 배양
   1. 절차 전반에 걸쳐 무균 기술을 사용하십시오. 생물 안전 작업대에 관개용 물(WFIr)을 사용하여 준비한 70% 에탄올 2ml/웰을 추가하여 골격을 재수화합니다. 각 우물의 벽 아래로 70% 에탄올을 분배하여 골격을 만지지 마십시오.
   2. 70% 에탄올을 조심스럽게 흡인하고 즉시 2ml/웰 Dulbecco의 Modified Eagle Medium F12(DMEM: F12)로 1분 동안 골격을 세척합니다. 세척 절차를 두 번 반복합니다. 최종 세척 후 DMEM: F12를 조심스럽게 흡입합니다.
   3. DMEM에 2ml/well의 라미닌(10μg/ml)을 첨가하여 골격을 코팅합니다: F12. 37 ° C의 5 % CO₂ 가습 인큐베이터에서 최소 2 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 따뜻한 DMEM: F12로 접시를 씻습니다.
   4. 150μl의 RMM+성장 인자(GF) 부피에 약 500,000개의 hNSC로 각 골격을 파종합니다.
   5. 세포가 골격에 정착할 수 있도록 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 37°C에서 3시간 동안 플레이트를 배양합니다.
   6. 각 웰에 3.5ml의 RMM을 추가하고 골격에서 세포가 빠지지 않도록 주의합니다.
   7. 플레이트를 7일 동안 배양하십시오. RMM 배지(3.5ml/well)를 1일(첫 수유) 후에 교체하고 첫 수유 후 2-3일 후에 다시 교체하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM: F12	인비트로젠	제21331-020	RMM 배지 준비용
인간 알부민 용액	박스터 헬스케어 리미티드	1501052	RMM 배지의 경우 최종 농도 0.03%에서 사용
트랜스페린, 인간 재조합	시그마	T8158	5 μg/ml의 최종 농도에서 사용되는 RMM 배지의 경우
푸트레신 DiHCl	시그마	P5780	RMM 배지의 경우 최종 농도 16.2μg/ml에서 사용
인슐린, 인간 재조합	시그마	I9278	5 μg/ml의 최종 농도에서 사용되는 RMM 배지의 경우
프로게스테론	시그마	P6149	최종 농도 60ng/ml에서 사용되는 RMM 배지의 경우
L-글루타민	인비트로젠	25030-24	2mM의 최종 농도에서 사용되는 RMM 매체의 경우
나트륨 셀레나이트	시그마	S9133	최종 농도 40ng/ml에서 사용되는 RMM 배지의 경우
bFGF	페프로텍	AF-100-15	RMM 배지에 첨가, 최종 농도 10ng/ml에서 사용
증권 시세	페프로텍	AF-100-188	RMM 배지에 첨가, 최종 농도 20ng/ml에서 사용
4-OHT	시그마	H7904	RMM 배지에 첨가, 100nM의 최종 농도에서 사용
라미닌	AMS 생명공학	Tel.: 3400-010-10
관개용 물	박스터 헬스케어	UKF7114
Alvetex 12웰 플레이트	리너베이트 주식회사	AVP002
에탄올	머 크	1.00986.1000