$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 식기 코팅, 매체 준비 및 hPSC 유지 관리를 위한 설정
- 식기 코팅
- 비트로넥틴(VTN) 코팅
- 완전히 해동될 때까지 VTN 바이알을 37°C 수조에 넣고 완전히 섞습니다.
- 100mm 페트리 접시의 경우 7mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)와 0.5mg/mL VTN을 혼합하고 접시에 VTN 용액을 첨가한 다음 실온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다.
- 기저막 매트릭스 코팅
- 기저막 매트릭스(재료 표 참조)의 바이알을 4°C의 얼음에서 밤새 해동합니다.
- 6웰 플레이트 1웰의 경우 Dulbecco의 Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12) 2mL를 100x 기저막 매트릭스 20μL와 혼합하고, 기저막 매트릭스 용액을 접시에 첨가하고, 파라핀 필름으로 접시를 감싸고, 4°C의 깨끗한 용기에 담아 하룻밤 동안 보관합니다. 가능한 한 빨리 작업하십시오. 코팅된 접시는 최대 2주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
- 폴리오르니틴(PO)/라미닌(LM)/피브로넥틴(FN) 코팅
- 첫날에는 24웰 플레이트의 한 웰에 대해 15μg/mL의 PO와 1x PBS 1mL를 혼합하고 37°C, 5% CO2에서 하룻밤 동안 배양합니다. LM과 FN을 모두 -20°C에서 하룻밤 동안 해동하고 완전히 해동될 때까지 4°C에서 보관하십시오.
- 둘째 날에는 PO 용액을 흡인하고 웰을 1x PBS로 2x 세척하고 2μg/mL의 LM과 2μg/mL의 FN을 포함하는 1x PBS 1mL를 첨가하고 37°C에서 5% CO2로 하룻밤 동안 배양합니다. 이 시점에서 LM/FN 용액이 있는 접시는 건조되지 않는 한 몇 달 동안 인큐베이터에 보관할 수 있습니다. 접시가 마르는 것을 방지하기 위해 1x PBS를 더 추가하십시오.
- 배지 준비
- E8 보충제 1병을 4°C에서 밤새 해동하여 Essential 8 medium(E8)을 준비합니다. 필요한 경우 보충제를 E8 배지 500mL 및 항생제와 혼합합니다.
메모: 작동하는 E8 솔루션은 2주 이내에 사용되어야 합니다.
- 90mL의 완전한 E8 배지와 10mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 총 100mL의 부피로 혼합하여 hPSC 동결 배지를 준비합니다. 필터는 살균합니다.
- 100mL의 필수 6(E6) 배지와 10μM SB431542, 1ng/mL 뼈 형태 유전 단백질 4(BMP4), 300nM CHIR99021 및 10μM Y27632를 총 100mL 용량으로 혼합하여 day 0 - day 1 분화 배지를 준비합니다.
- 100mL의 E6 배지와 10μM SB 및 0.75μM CHIR99021을 총 부피 100mL와 혼합하여 2일차부터 10일차까지의 분화 배지를 준비합니다.
- 총 부피 100mL에 대해 2mL의 B27(50x), 1mL의 N2(100x), 2mM L-글루타메이트, 3μM CHIR99021 및 10ng/mL 섬유아세포 성장 인자-2(FGF2)와 neurobasal 배지를 혼합하여 10일차부터 14일차 스페로이드 배지를 준비합니다.
- 모든 수유에 대해 0.5μM의 신선한 레티노산(RA)을 10일에서 14일째 스페로이드 배지에 추가하여 스페로이드 장기 유지를 위해 14일차에서 28일차 배지를 준비합니다.
메모: RA는 항상 -80°C로 유지하십시오.
- 총 부피 100mL에 대해 2mL의 B27(50x), 1mL의 N2(100x), 2mM L-글루타메이트, 25ng/mL 신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF), 25ng/mL 뇌 유래 신경영양인자(BDNF), 25ng/mL 신경 성장 인자(NGF), 200μM 아스코르브산 및 0.2mM 디부티릴 고리형 아데노신 일인산염(dbcAMP)을 혼합하여 SymN 성숙 배지를 준비합니다. 이 솔루션은 2주 이내에 사용해야 합니다. 매번 먹이기 전에 0.125μM의 신선한 RA를 추가합니다. 이 솔루션은 14일(옵션 1) 또는 28일(옵션 2)부터 사용됩니다.
- 총 부피 100mL에 대해 DMEM을 2% FBS, 2mM L-글루타메이트 및 항생제와 혼합하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액을 준비합니다.
- hPSC 유지 관리
- hPSC의 해동 및 유지
- VTN 코팅 100mm 접시 1개를 준비합니다.
- 액체 질소에서 직접 hPSC 바이알을 해동하려면 바이알을 37°C 수조에 넣고 튜브가 해동될 때까지 물 속에서 튜브를 조심스럽게 흔듭니다. 해동된 hPSC를 10mL의 1x PBS가 들어 있는 15mL 튜브로 옮기고 200 x g에서 4분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 튜브에 E8 배지 1mL를 추가합니다. 펠릿을 완전히 재현탁시키기 위해 몇 번 피펫팅한 다음 9mL의 E8 배지를 더 추가하여 총 10mL에 도달합니다.
- 100mm 접시에서 VTN 용액을 흡입합니다.
- hPSC를 100mm 접시에 옮기고 세포가 접시에 고르게 분포되도록 부드럽게 흔들어(원이 아닌 위-아래 및 왼쪽-오른쪽) 흔듭니다.
- 37 ° C에서 5 % CO2 로 배양하십시오.
- 다음 날에는 모든 배지를 흡인하고 E8 10mL를 공급합니다.
- 다음 3-4일 동안 매일 이런 식으로 먹이고 나눠 준비할 것입니다.
- hPSC 분할
참고: 분할 지점의 hPSC는 80%–90% 융합되어야 합니다. 매끄럽고 밝은 가장자리를 가진 큰 군체를 관찰해야 합니다. 그러나 각 군체 간의 접촉은 피해야 합니다(그림 1B, 0일 및 그림 4B).
- 필요에 따라 VTN 코팅된 100mm 접시를 준비합니다.
- E8을 흡인하고 1x PBS로 1x 분할해야 하는 접시를 씻습니다.
- 1x PBS를 흡입하고 0.25M EDTA 4mL를 추가합니다. 37 ° C, 5 % CO2.
에서 2 분 동안 배양
메모: hPSC는 작은 콜로니로 분할/재플레이팅해야 합니다. 단일 세포로의 분리를 방지하기 위해 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 2분 이상 처리하지 마십시오. 세포는 2분 처리 후에도 접시 표면에 여전히 부착되어 있어야 합니다.
- EDTA를 흡인하고, 10mL의 E8 배지를 접시 표면에 강하게 피펫팅하여 콜로니를 분리하고, 15mL 튜브에 모든 배지와 세포를 수집합니다.
- hPSC가 80%–90% 포화도인 경우 군체를 1:15-1:20으로 분할합니다. 예를 들어, hPSC를 1:20 단위로 100mm 접시 1개로 분할하려면 500μL의 E8/hPSC 용액을 9.5mL의 새로운 E8 배지와 혼합합니다.
- VTN 코팅 100mm 접시에 hPSC 플레이트를 만듭니다.
메모: 각 연구자와 세포주에 대한 이상적인 분할 비율을 독립적으로 설정하는 것이 좋습니다.
- hPSC 동결
- 쪼갤 준비가 된 hPSC 100mm 접시 1개의 경우 3개의 극저온 여과액과 3.5mL의 동결 매체를 준비합니다.
알림: 미디어와 바이알은 사용할 때까지 4°C 또는 얼음 위에 보관해야 합니다.
- E8을 흡입하고 2x PBS로 접시를 1x 세척합니다.
- 1x PBS를 흡입하고 0.25M EDTA 4mL를 첨가하고 37°C에서 5% CO2.
로 2분 동안 배양합니다.
참고: hPSC는 분열될 때 작은 집락으로 동결되어야 합니다. 단일 세포로 분리되는 것을 방지하기 위해 2분 이상 EDTA로 세포를 처리하지 마십시오. 세포는 2분 처리 후에도 접시 표면에 여전히 부착되어 있어야 합니다.
- EDTA를 흡인하고, 접시 표면에 10mL의 1x PBS를 강력하게 피펫팅하여 콜로니를 분리하고, 50mL 튜브에 모든 배지와 세포를 수집합니다.
- 1x PBS 20mL를 추가하고 200 x g에서 4분 동안 원심분리하여 남아 있는 EDTA를 세척합니다.
- 상등액을 버리고 펠릿을 3mL의 동결 매체에 재현탁합니다.
- hPSC를 각각 1mL씩 3개의 극저온 용액에 고르게 분배합니다.
- -80°C에서 조절된 냉동 상자 또는 스티로폼 샌드위치에 하룻밤 동안 보관하여 온도를 천천히 떨어뜨린 다음 액체 질소 탱크로 옮겨 장기 보관합니다.
2. 분화를 시작하기 위한 hPSC 시딩(0일차)
참고: hPSC는 안정화 후(즉, 해동 후 2–3배 분할) 분화 준비가 되어야 합니다. 군체가 건강하고 가장자리가 매끄럽고 광택이 있으며 분화가 최소화되어 있는지 확인하십시오(그림 2B).
- 필요에 따라 0일차 하루 전에 기저막 매트릭스 코팅 접시(24웰 또는 6웰 접시)를 준비합니다. 차별화를 시작할 때 접시를 RT로 가져오세요.
- 필요에 따라 하루를 0-1 분화 매체로 만듭니다.
- 합류점에서 E8을 흡인하고 hPCS를 분할할 준비를 하고 1x PBS로 접시를 2x 세척합니다.
- 100mm 접시 당 0.25M EDTA 7mL를 추가하고 37 ° C, 5 % CO2에서 15 분 동안 배양합니다
메모: 이 시점에서 EDTA 처리는 단일 세포로 분산되도록 연장됩니다.
- 모든 hPSC를 피펫으로 분리하고(부유해야 함) 50mL 튜브로 옮깁니다. EDTA 용액과 동일한 양 또는 그 이상의 1x PBS를 첨가하여 EDTA를 희석합니다.
- 200 x g에서 4분 동안 원심분리기
- 상등액을 버리고 1mL의 day 0–1 분화 배지를 첨가하고 피펫을 넣어 세포를 균질화합니다. 더 많은 매체를 첨가하여 세포 용액을 세포를 계수하기에 이상적인 농도로 희석하기 위해 혼합하십시오 .
메모: 세포 용액을 과도하게 희석하지 마십시오. 100mm 접시 1개에서 추출한 세포를 5mL의 배지에 희석하여 시작해야 합니다.
- 자동 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
- 낮은 최종 부피에서 125,000 cells/cm2에 도달하기 위해 필요에 따라 세포 용액을 희석합니다(예: 6웰 접시의 경우 웰당 2mL 또는 24웰 접시의 경우 웰당 500μL).
메모: 부피가 작으면 세포가 더 빨리 부착하는 데 도움이 됩니다.
- 코팅된 접시에서 모든 기저막 매트릭스 용액을 흡인하고 세포 용액을 웰에 플레이트합니다.
- 37 ° C에서 5 % CO2 로 배양하십시오.
3. 신경능선세포 유도 (1일차부터 10일차까지, 그림 1A)
- 1일차에 0-1일차 분화 배지(6웰 접시의 경우 웰당 3mL, 24웰 접시의 경우 웰당 1mL)를 세포에 공급합니다.
- 2일차에 2일차-10일차 분화 배지(6웰 접시의 경우 웰당 3mL, 24웰 접시의 경우 웰당 1mL)를 세포에 공급합니다.
- 이제부터 10일째까지 격일로 세포에 먹이를 주어야 합니다(즉, 다음 먹이 주는 날은 4일째가 됩니다).
메모: 6일차부터 NC 능선을 감지해야 합니다(그림 1B). 분화가 일어나고 있는지 확인하기 위해 SOX10/AP2a에 대해 염색하고 분화 시간에 따라 마커 유전자 발현에 사용할 수 있는 더 작은 웰(즉, 24개의 웰)에서 병렬 분화 배양을 수행하는 것이 좋습니다(그림 1B, C).
- 셀을 정렬하는 경우 섹션 4로 진행합니다. 그렇지 않으면 섹션 5로 진행합니다.
4. 신경능선 마커 CD49D에 대한 형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 스페로이드의 NC 세포 응집
참고: FACS 분류의 경우 샘플을 얼음 위에 보관해야 하며 염색 후 분류할 때까지 빛에 노출되지 않아야 합니다.
- 셀이 정렬된 경우 FACS 버퍼를 준비합니다.
- 10-14일 스페로이드 배지를 준비합니다.
- 10일째에 매체를 제거하고 1x PBS로 1x 세척합니다.
- 6웰 접시의 경우 웰당 2mL, 24웰 접시의 경우 웰당 1mL의 해리 용액(재료 표 참조)을 추가하고 37°C, 5% CO2에서 20분 동안 배양합니다.
- 모든 hPSC를 파이펫으로 분리하고 50mL 튜브로 옮깁니다.
- 튜브의 나머지 부분을 FACS 버퍼와 원심분리기로 200 x g에서 4분 동안 채웁니다
메모: 각 50mL 튜브는 최대 20mL 이하의 세포 용액을 수용할 수 있습니다. FACS 버퍼의 부피는 해리 용액을 중화할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다.
- 상층액을 버리고 적절한 양의 FACS 완충액(6웰 플레이트의 웰당 ~2mL)으로 세포를 재현탁한 다음 셀 수를 계산하여 세포 수를 계산합니다.
- 다음 샘플을 준비합니다.
- 샘플 1(염색되지 않은 대조군): 400μL의 FACS 완충액에 있는 1 x 106 셀. 20μm 스트레이너 캡을 통해 세포를 여과하고 튜브를 얼음 위에 둡니다.
- 샘플 2(DAPI 전용 대조군): 0.5ug/mL 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 포함하는 400μL의 FACS 완충액에 1 x 106개 셀. 스트레이너 캡이 있는 FACS 튜브를 통해 세포를 여과하고 튜브를 얼음 위에 유지합니다.
- 샘플 3(CD49D 표지): 15mL 튜브에 phycoerythrin/cyanine7(PE/Cy7) 접합 CD49D 항체(FACS 완충액 100μL당 1 x 106 세포에 대해 5μL)를 포함하는 FACS 완충액으로 나머지 세포를 현탁하고 얼음에서 20분 동안 배양합니다.
- 튜브를 FACS 버퍼로 채우고 200 x g에서 4분 동안 원심분리기를 채웁니다.
- 상등액을 버리고 제조업체의 지침에 따라 0.5ug/mL DAPI를 함유한 1mL의 FACS 완충액에 5–10 x10 6개의 세포마다 재현탁합니다.
- 스트레이너 캡으로 FACS 튜브를 통해 세포를 여과하고 튜브를 얼음 위에 유지합니다.
- 2mL의 FACS 완충액이 들어 있는 채취 FACS 튜브를 준비합니다.
- DAPI 및 PE-Cy7을 검출할 수 있는 레이저로 FACS 기계를 분류하여 CD49D+ 집단을 분리합니다.
- 정렬 후 정렬된 셀을 계산합니다.
- 분류된 모든 세포를 원심분리하고 10-14일째 스페로이드 배지에서 배지 500μL당 6개의 최종 농도인 0.5 x 106개 세포로 재현탁합니다.
- 플레이트: 0.5 x 10, 웰당6셀, 초저 부착물, 24웰 플레이트.
- 세포를 37 ° C에서 5 % CO2 로 배양합니다.
5. 스페로이드의 NC 세포 응집
- FACS를 사용하여 NC 세포를 분리하지 않고 직접 스페로이드로 응집하는 경우 먼저 4.2–4.5단계에 설명된 대로 세포를 준비합니다.
- 튜브의 나머지 부분을 1x PBS로 채우고 200 x g에서 4분 동안 원심분리합니다.
- 상등액을 버리고 적절한 양의 10-14일 스페로이드 배지(예: 6웰 플레이트의 경우 웰당 ~2mL의 배지)로 세포를 재현탁한 다음 셀 수를 계산하여 세포 수를 계산합니다.
- 10-14일째 스페로이드 배지의 세포를 배지 500μL당0.5 x 10 6개의 세포로 희석합니다.
- 플레이트: 500μL의 셀, 웰당 현탁액, 초저 부착 24웰 플레이트.
- 세포를 37 ° C에서 5 % CO2 로 배양합니다.
6. NC 스페로이드 유지 및 교감신경 전구 유도(10일차부터 14일차까지, 그림 3A)
- 옵션 1: 최소 스페로이드 배양
- 11일차에 10일차부터 기존 배지를 흡인하지 않고 10-14일차 스페로이드 배지 500μL를 NC 스페로이드에 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 로 배양하십시오.
- 12일차에 플레이트를 기울여 웰의 한쪽에 NC 스페로이드를 축적합니다. 조심스럽게 흡입하여 가능한 한 많은 배지를 버리고 10-14일차 스페로이드 배지 1mL를 공급합니다.
- 14일째까지 매일 세포에 먹이를 공급하십시오.
- 선택 사항: 스페로이드가 응집되어 큰 덩어리를 생성하는 경우 피펫을 사용하여 스페로이드 덩어리를 분해합니다. 이렇게 하면 개별 스페로이드가 너무 커지지 않습니다.
메모: 이상적인 스페로이드 크기 범위는 약 100–500μm여야 합니다. 이 범위 내에서 개별 스페로이드의 크기는 중요하지 않습니다. 그러나 매끄럽고 선명한 가장자리(그림 2 및 그림 4)와 같은 형태는 추가 성공에 중요합니다. 14일째에, 각 24웰 플레이트는 이상적으로 위에서 언급한 크기 범위 내에서 서로 다른 크기의 약 50-60개의 스페로이드를 포함합니다.
- 옵션 2: 확장된 스페로이드 배양
- 15일째에 NC 스페로이드를 유지하기 위해 0.5μM RA를 함유한 10-14일차 스페로이드 배지 1.5mL를 공급합니다. 37 ° C, 5 % CO2.
에서 배양하십시오.
메모: RA는 수유할 때마다 신선하게 첨가해야 하며 항상 -80°C에서 보관해야 합니다.
- 이제부터 28일까지 격일로 먹이를 준 다음 스페로이드 도금을 계속하십시오(섹션 7.1).
메모: 성장하는 스페로이드는 1mL 피펫으로 피펫팅하여 분해하여 주당 약 1회 분할합니다. 그들은 대략 1:2–1:4의 비율로 나뉩니다. 2주간의 확장 기간 내에 세포의 수는 대략 4배 로 늘어날 것입니다.
7. 교감신경(SymN) 분화 및 성숙 (옵션 1: 14일째 이후; 옵션 2: 28일째 이후)
- 일반 접시에 스페로이드 플레이팅
- PO/LM/FM 코팅된 24웰 플레이트를 준비합니다.
- 0.125μM RA(모든 사료마다 신선 사료 추가) 및 10μM Y27632(14일에만 해당)를 포함하는 symN 배지를 준비합니다.
- 14일째에 플레이트를 기울여 웰의 한쪽에 NC 스페로이드를 축적합니다. 조심스럽게 흡인하고 가능한 한 많은 배지를 버리고 symN 배지 1mL를 공급합니다.
- 코팅된 플레이트에서 LM/FN을 제거합니다.
- 24웰 플레이트의 각 웰을 새로운 코팅된 24웰 플레이트의 4개의 개별 웰로 분할하고 플레이트합니다. 각 원래 웰에는 ~50–60개의 스페로이드를 포함하는 1mL가 있습니다. 이를 통해 250 μL가 생성되며, 새 플레이트의 각 웰에 대해 약 10–15개의 스페로이드가 포함됩니다.
- 웰당 250μL의 배지를 추가로 추가합니다.
메모: 이것은 1:4의 분할입니다. 스페로이드가 용액 내에 적절하게 분포되어 분할이 비교적 균일한지 확인합니다. 스페로이드의 수는 최종 숫자가 symN 생성 성공에 영향을 미치지 않기 때문에 계산되지 않습니다.
- 37 °C, 5 % CO2 에서 배양하십시오.
- 15일째(또는 옵션 2의 경우 29일째)에 모든 배지를 0.125μM RA를 함유한 symN 배지 1mL로 교체하여 먹이십시오. 이제부터 20일째(또는 옵션 2의 경우 35일)까지 2일마다 뉴런에 영양을 공급해야 한다.
- 20일째(또는 옵션 2의 경우 35일) 이후에는 기존 배지의 절반(500μL)만 조심스럽게 교체하여 뉴런에 영양을 공급해야 합니다. 이제부터는 배지가 빨리 노랗게 변하지 않는 한 매주 먹이를 주십시오.
- 원하는 시점까지 매주 먹이를 주세요.
참고: symN은 신경절과 같은 구조로 응집되는 경향이 있으며 배양 접시에서 분리되는 경향이 있습니다. 이를 방지하기 위해서는 반쪽짜리 먹이와 최소한의 취급이 권장됩니다.
