Generation and Differentiation of Primary Neurospheres from Zebrafish Neural Stem Cells(제브라피시 신경 줄기세포에서 1차 신경구의 생성과 분화)

초록

출처: Lopez-Ramirez, M. A. et al., Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres(성인 제브라피시 뇌 유래 신경구의 격리 및 문화).J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 1차 신경구의 생성과 분화를 보여줍니다. 제브라피시의 신경줄기세포는 성장인자(growth factor)가 존재할 때 자기재생능력을 가진 자유롭게 떠다니는 신경구체(neurosphere)로 증식하고, 나중에 신경교세포(glial cell)와 뉴런(neuron)으로 분화합니다.

프로토콜

1. 준비

사항

1. 해부 배지 10ml를 준비하고 Dulbecco's Modified Eagle Medium F12(DMEM/F12) 9.8ml에 100x 페니실린-스트렙토마이신 200μl를 첨가합니다.
2. 조직 배양을 위해 물 10ml에 L-시스테인 용액을 준비하고 L-시스테인 120mg을 첨가합니다. L-시스테인 용액을 4°C에서 최대 2주 동안 보관하거나 -20°C의 부분 표본에서 최대 1년 동안 보관합니다.
3. DNase I 용액 준비: 조직 배양을 위한 물 1ml에 DNase I 10mg을 추가합니다. DNase I 용액을 4°C에서 최대 2개월 동안 보관합니다.
4. 파파인 용액 준비: 파파인 용액을 준비하려면 100μl 파파인(약 140단위), 100μl DNase I(1%) 및 200μl L-시스테인(12mg/ml)을 5mL의 DMEM/F12에 추가합니다. 파파인 용액은 매번 신선하게 준비하고 사용하기 전에 0.22μm 기공 크기의 필터로 살균하십시오.
5. 세척 용액 준비: 세척액 100ml를 준비하려면 650μl 포도당 45%, 500μL 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, HEPES 1M 및 5ml 소 태아 혈청(FBS)을 93.85ml Dulbecco의 인산....

결과

그림 1: 제브라피시 뇌 유래 신경구의 분화.(A-C, E) 1일(A, DiVd1), 3일(B, DiVd3) 및 4일(C 및 D, DiVd4) 동안 Z-분화 매질에서 배양된 전체 뇌 유래 신경구의 위상차 이미지. (E) 12개월 된 Tg(GFAP:DsRed) 제브라피쉬의 전체 뇌의 등쪽 보기. 텔렌스팔론(tel), 텍툼(tectum, Tec) 및 소뇌(Cer)를 그림과 같이 해부하고 수집하였다. (D) 통로 0 (P0), 1 (P1) 및 2 (P2)에.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DPBS 1배	생명 기술	14190-144
DMEM/F12 1배	생명 기술	제11330-032
L-시스테인 염산염 일수화물	시그마	C6852-25G
나-27	생명 기술	제17504-044
N-2	생명 기술	제17502-048	N-2 보충제(100x) 액상
헤페스	생명 기술	15630	1분
D-(+)-포도당 45%	시그마	G8769 (영문
페니실린-스트렙토마이신	생명 기술	15140-122
소 태아 세럼	생명 기술	16000044
인간 FGF-basic	페프로텍	100-18B
인간 EGF	페프로텍	AF-100-15
인슐린	시그마	I5500-50 밀리그램
DNA제	시그마	DN25-10mg
파파인	워딩턴 생화학 공사	LS003126
마트리겔	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	356234
PFA는	티씨아이	P0018
PBS (PBS)	아메리칸바이오	AB11072-04000
트리카인 MS-222	시그마	A5040	4 mg/ml의 원액.
트리콜드 젤	시그마	TGP8	젤 팩
트리판 블루 스테인	생명 기술	15250061

년 호 호 호 년 ) 년