Generation and Differentiation of Primary Neurospheres from Zebrafish Neural Stem Cells(제브라피시 신경 줄기세포에서 1차 신경구의 생성과 분화)

초록

출처: Lopez-Ramirez, M. A. et al., Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres(성인 제브라피시 뇌 유래 신경구의 격리 및 문화).J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 1차 신경구의 생성과 분화를 보여줍니다. 제브라피시의 신경줄기세포는 성장인자(growth factor)가 존재할 때 자기재생능력을 가진 자유롭게 떠다니는 신경구체(neurosphere)로 증식하고, 나중에 신경교세포(glial cell)와 뉴런(neuron)으로 분화합니다.

프로토콜

1. 준비

사항

1. 해부 배지 10ml를 준비하고 Dulbecco's Modified Eagle Medium F12(DMEM/F12) 9.8ml에 100x 페니실린-스트렙토마이신 200μl를 첨가합니다.
2. 조직 배양을 위해 물 10ml에 L-시스테인 용액을 준비하고 L-시스테인 120mg을 첨가합니다. L-시스테인 용액을 4°C에서 최대 2주 동안 보관하거나 -20°C의 부분 표본에서 최대 1년 동안 보관합니다.
3. DNase I 용액 준비: 조직 배양을 위한 물 1ml에 DNase I 10mg을 추가합니다. DNase I 용액을 4°C에서 최대 2개월 동안 보관합니다.
4. 파파인 용액 준비: 파파인 용액을 준비하려면 100μl 파파인(약 140단위), 100μl DNase I(1%) 및 200μl L-시스테인(12mg/ml)을 5mL의 DMEM/F12에 추가합니다. 파파인 용액은 매번 신선하게 준비하고 사용하기 전에 0.22μm 기공 크기의 필터로 살균하십시오.
5. 세척 용액 준비: 세척액 100ml를 준비하려면 650μl 포도당 45%, 500μL 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, HEPES 1M 및 5ml 소 태아 혈청(FBS)을 93.85ml Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 1x에 추가합니다. 사용하기 전에 0.22μm 기공 크기 필터로 세척액을 살균하십시오. 세척액은 4°C에서 최대 2개월 동안 보관하십시오.
6. 인슐린 용액 준비: 인슐린 용액 2ml를 준비하려면 조직 배양을 위해 물 2ml에 10N 수산화나트륨(NaOH) 25μl와 인슐린 100mg 방울을 추가합니다.
7. 표피 성장 인자(EGF) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF) 용액 준비: 두 유사분열제를 100μg/ml 농도로 DMEM/F12에 모두 용해시킵니다. -20 °C에서 10 μl 분취량으로 보관하십시오.
8. B-27 및 N-2 배지 준비: B-27 및 N-2 보충제를 -20°C에서 각각 500μl 및 1ml 부분 표본으로 보관합니다.
9. Z-분화 조건 배지 준비: Z-분화 조건 배지 100ml를 준비하기 위해 40μl 인슐린(50mg/ml), 500μl B-27, 1ml N-2, 650μl 포도당 45% 및 1ml의 100 x 페니실린-스트렙토마이신 1ml를 97.81ml의 DMEM/F12에 첨가합니다. 사용하기 전에 0.22μm 공극 크기 필터로 Z-분화 조건 배지를 멸균합니다. Z-분화 조건 배지를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.
10. Z-조건 배지 준비: 50ml의 Z-조건 배지를 준비하려면 10μl의 EGF와 10μl의 FGF를 50ml의 멸균 Z-분화 조건 배지(20ng/ml)에 추가합니다. Z-condition 배지를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관하십시오.
11. 분화 배양을 위한 코팅 용액 준비: 5ml 세포외 코팅 용액의 경우 100μl의 세포외 기질 용액(예: Matrigel)을 4.9ml의 DMEM/F12에 추가합니다. 세포외 기질 용액을 얼음 위에서 4°C에서 해동합니다. 해동된 후에는 최대 2주 동안 4°C에서 유지하십시오.

2. 성체 제브라피시 뇌 해부

1. 100mm x 15mm 페트리 접시에 젤 얼음 팩을 채워 해부 침대를 준비합니다. 그런 다음 페트리 접시에 뚜껑을 덮고 젤이 얼 때까지 -20 ° C에서 배양합니다. 뚜껑 위에 깨끗한 여과지를 정사각형으로 놓고 여과지와 페트리 접시를 모두 플라스틱 필름으로 감쌉니다.
2. 매번 사용하기 전에 모든 현미해부 기구를 70% 에탄올 또는 열로 세척하고 살균하십시오. 모든 멸균된 해부 기구를 해부 현미경 근처에 놓고 안락사 직전에 광섬유 조명이 있는 현미경 아래에 해부 베드를 놓습니다.
3. 전체 뇌 신경구 준비를 위해 성체 제브라피시 2마리를 모으고, 해부된 뇌 영역에서 신경구를 생성하기 위해 3-4마리의 제브라피시를 수집합니다.
4. 성인 제브라피시(8-12개월)를 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 안락사시킵니다. 다음으로, 물고기를 75% 에탄올에 5-10초 동안 담그고 재빨리 해부 침대에 넣은 다음 수술용 칼날을 사용하여 아가미 수준에서 참수합니다.
   1. 동물을 안락사시키려면 동물의 심장 박동이 점차 느려지고 혈액 순환이 멈출 때까지 트리카인 메탄 설포네이트를 과다 투여한 다음 얼음물에 담그십시오.
5. 머리의 등쪽을 아래로 돌리고 가위를 사용하여 자른 쪽에서 입까지 세로로 자릅니다. 겸자를 사용하면 두개골 기저부가 드러나고 인접한 모든 조직을 제거할 수 있습니다. 척수의 시작 부분에서 구조쪽으로 두개골의 측벽을 자릅니다.
6. 가위를 사용하여 시신경을 자르고 제거한 다음 지각 수준에서 두개골의 가장 외측 부분의 양쪽을 제거합니다. 머리를 복부 쪽을 위로 돌립니다. 집게를 사용하여 두개골의 가장 정점 부분의 나머지 부분을 벗겨냅니다.
7. 두개골의 나머지 부분과 함께 뇌를 해부 매체가 있는 새 접시로 옮깁니다(1.1). 마이크로 나이프의 플라스틱 손잡이를 사용하여 모든 뇌 구조를 그대로 유지하면서 해부 매체의 뇌 조직을 청소합니다.
8. 이 시점부터 전체 제브라피시 뇌를 사용하여 프로토콜을 계속합니다.
   1. 또는 이 프로토콜을 특정 뇌 영역에 적용하여 전체 제브라피시 뇌 또는 새로운 메스로 절개한 텔렌스팔론(telencephalon), 텍툼(tectum)/디엔세팔론(tectum/diencephalon) 또는 소뇌(cerebellum)에서 신경구를 생성합니다. 그림 1에 따라 신경 특이적 형광 제브라피시 신경 형질전환 라인을 사용하여 관심 있는 뇌 영역을 해부합니다.

3. 성인 뇌의 단세포 해리

1. 생물 안전 캐비닛에서 모든 후속 작업을 수행하십시오. 뇌 조직을 800μl의 해부 배지가 들어 있는 1.5ml 튜브로 옮깁니다(1.1단계에서 준비). 뇌 조직을 건드리지 않고 피펫팅으로 해부 매체를 제거합니다.
2. 파파인 용액 500μl를 첨가하고(1.4단계) 37°C에서 10분간 뇌조직을 소화한다. 세포 생존력을 감소시킬 수 있으므로 15분 이상 배양하지 마십시오.
3. 배양 후, 바닥에서 ~0.25인치에서 절단된 1,000μl 피펫 팁을 사용하여 파파인 용액 500μl가 포함된 뇌 조직을 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 같은 팁으로 10회 위아래로 천천히 피펫팅하여 뇌 조직을 부드럽게 해리합니다. 15회 이상 위아래로 파이핑하지 말고 세포 생존력을 변경할 수 있으므로 이 단계에서 기포를 생성하지 마십시오.
4. 37°C에서 10분 동안 뇌 조직을 다시 배양한 다음 절단되지 않은 1,000 μl의 일반 팁을 사용하여 10-13회 위아래로 피펫팅합니다. 세포 사멸을 방지하기 위해 15회 이상 위아래로 피펫을 사용하지 마십시오.
5. 세척액 2ml를 첨가하여(1.5단계) 세포 현탁액을 800 x g에서 실온(RT)에서 5분 동안 원심분리하여 효소 분해를 중지합니다. 상층액을 조심스럽게 기울인 후 손가락으로 튜브를 세게 두드린 다음 1,000 μl의 일반 팁으로 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 나머지 용액에 다시 현탁시킵니다. 다음으로 세척액 2ml를 넣으십시오.
6. 이 단계에서 현미경으로 단일 세포 현탁액이 얻어졌는지 확인합니다. RT에서 5분 동안 800 x g에서 세포 현탁액을 다시 원심분리합니다.상층액을 제거하고 1ml의 새로운 Z-조건 배지를 사용하여 펠릿을 다시 현탁합니다(단계 1.10).
7. trypan blue를 사용하여 세포를 염색하고 blue dead cell을 제외하여 혈구계를 사용하여 살아있는 세포를 계수합니다. 각 웰에 200μl의 세포 현탁액과 300μl의 새로운 Z-상태 배지가 있는 24웰 플레이트를 준비합니다. ~500 cells/μl의 밀도에서 종자 세포. 제브라피시 뇌 유래 신경구는 37°C에서 잘 자라지 않기 때문에 배양된 세포를 30°C에서 5% CO₂로 인큐베이터에 유지하십시오.

4. 1차 신경구의 생성

1. 1일 체외(DiV1) 후 성인 전뇌에서 얻은 단세포 현탁액을 현미경으로 관찰하고 우물 중앙에 파편이 쌓였는지 확인합니다. 약 100μl의 배지(가능한 경우 더 적게)를 피펫팅하여 이물질을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로 100μl의 새로운 Z-조건 배지를 추가합니다. 이때 단일 세포 현탁액을 관찰해야 합니다(그림 2A DiV1).
2. in vitro 2일(DiV2) 후 배양된 세포를 확장시킵니다. 팁이 절단된 1,000μl 피펫을 사용하여 각 웰에서 250μl의 세포 현탁액을 수집하여 새 웰로 옮깁니다. 250μl의 새로운 Z-조건 배지를 모든 웰에 추가합니다. 배양된 세포를 확장하기 전에 웰 전체를 위아래로 피펫팅하여 현탁액을 매우 부드럽게 균질화합니다.
3. 다음 4일 동안 체외(DiV4) 4.1단계 및 4.2단계를 반복합니다. 신경구체의 크기가 점진적으로 증가하는 것은 DiV3 및 DiV4에서 우물의 중심과 가장자리에서 볼 수 있어야 합니다(그림 2B 및 C).
   메모: 일차 신경구는 다능성을 평가하기 위해 통과 또는 분화를 위해 처리할 수 있습니다. 또는 분화 과정에서 특정 유전자의 역할을 특성화하기 위해 nucleofection 또는 lipo-transfection을 위해 처리할 수 있습니다.

5. 1차 신경구의 패시지잉

1. 각 웰에서 250μl의 조직 배양물을 제거하고 1ml 피펫으로 DiV4 신경구를 기계적으로 해리합니다. 기포 형성은 세포 사멸을 증가시킬 수 있으므로 너무 빨리 위아래로 배관하지 마십시오.
2. 혈구계로 세포를 계수하고 250μl의 1차 배양 상등액에 800 cells/μl를 24-well plate의 각 well에 분배합니다.
3. 각 웰에 250μl의 Z 조건 배지를 추가합니다.
4. 시험관 2일(DiV2) 후, 4.2단계 및 4.3단계에서 보고된 바와 같이 배양된 세포를 확장시킵니다.

6. 1차 신경구의 분화

1. 커버 유리를 70% 에탄올에 10분 동안 담가 소독한 다음 12웰 플레이트의 각 웰에 넣어 RT에서 커버 유리를 건조시킵니다.
2. 커버 유리의 중앙에 300μl의 세포외 코팅 용액(단계 1.11)을 추가하여 커버 유리가 넓게 팽창하여 커버 유리 전체를 덮을 수 있도록 합니다. 그런 다음 37°C에서 1시간 동안 배양합니다(가습된 세포 배양 인큐베이터 사용).
3. 배양 후 세포외 코팅액을 제거하고 커버 유리를 37°C에서 2시간 동안 건조시킵니다.
4. 각 웰에서 250μl의 조직 배양물을 제거합니다. 위아래로 피펫팅하여 1ml 피펫(끝이 더 넓은 피펫 포함)으로 웰당 모든 DiV4 1차 신경구를 기계적으로 해리합니다.
5. 이전에 준비된 세포외 기질이 코팅된 커버 유리(단계 6.1-6.3)에서 4 x 10³ cells/ml의 세포 밀도로 종자 해리된 신경구 세포 현탁액을 유지하고 기질에 부착될 때까지 5% CO₂에서 30°C에서 30분 이상 유지합니다. 그런 다음, 배양 배지를 제거하고 예열된 신선한 Z-분화 조건 배지 1ml를 빠르게 첨가한 후, 5%_CO2에서 30°C에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
6. 이틀에 한 번씩, 세포 분화 기간 동안 Z-분화 조건 배지의 절반을 교체합니다.

결과

그림 1: 제브라피시 뇌 유래 신경구의 분화.(A-C, E) 1일(A, DiVd1), 3일(B, DiVd3) 및 4일(C 및 D, DiVd4) 동안 Z-분화 매질에서 배양된 전체 뇌 유래 신경구의 위상차 이미지. (E) 12개월 된 Tg(GFAP:DsRed) 제브라피쉬의 전체 뇌의 등쪽 보기. 텔렌스팔론(tel), 텍툼(tectum, Tec) 및 소뇌(Cer)를 그림과 같이 해부하고 수집하였다. (D) 통로 0 (P0), 1 (P1) 및 2 (P2)에...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DPBS 1배	생명 기술	14190-144
DMEM/F12 1배	생명 기술	제11330-032
L-시스테인 염산염 일수화물	시그마	C6852-25G
나-27	생명 기술	제17504-044
N-2	생명 기술	제17502-048	N-2 보충제(100x) 액상
헤페스	생명 기술	15630	1분
D-(+)-포도당 45%	시그마	G8769 (영문
페니실린-스트렙토마이신	생명 기술	15140-122
소 태아 세럼	생명 기술	16000044
인간 FGF-basic	페프로텍	100-18B
인간 EGF	페프로텍	AF-100-15
인슐린	시그마	I5500-50 밀리그램
DNA제	시그마	DN25-10mg
파파인	워딩턴 생화학 공사	LS003126
마트리겔	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	356234
PFA는	티씨아이	P0018
PBS (PBS)	아메리칸바이오	AB11072-04000
트리카인 MS-222	시그마	A5040	4 mg/ml의 원액.
트리콜드 젤	시그마	TGP8	젤 팩
트리판 블루 스테인	생명 기술	15250061