검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 뇌 오가노이드 생성 (23일)
- 신경외배엽 시작 (5일)
참고: 차별화를 시작하기 전에 다음 사항을 고려해야 합니다. 인간 iPSC를 얻기 위한 재프로그래밍 방법(렌티바이러스, 센다이 바이러스, 에피솜 또는 마이크로RNA 기반 등)은 모든 환자 및 대조군 iPSC 라인에서 이상적으로 동일해야 합니다. 발표된 프로토콜을 기반으로 하는 다양한 재프로그래밍 키트 및 지침을 사용할 수 있습니다. human iPSC 라인의 품질은 최적의 차별화를 달성하기 위한 핵심입니다. 현미경으로 집락 및 세포 형태를 모니터링하고 Oct3/4, Nanog 또는 TRA-1-60과 같은 마커의 발현을 테스트하여 다능성을 검증합니다.
- Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 매트릭스로 코팅된 접시에서 배지 A에서 피더가 없는 조건에서 인간 iPSC를 배양합니다.
메모: 정의된 배양 조건을 유지하고 분화가 시작되기 전에 마우스 배아 공급세포(MEF)를 제거하기 위한 추가 단계를 피하기 위해 피더 및 혈청 없이 인간 iPSC를 성장시킵니다. 인간 iPSC가 분화를 시작하기 위한 최적의 통과 수는 재프로그래밍 시 15번 경과부터 총 70번 전도 통로까지입니다. 계대 배양(passaging) 시, 기계적 응력이 낮은 적절한 세포 분리 용액과 2mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포가 응집될 때 hiPSC 콜로니를 분리하여 응집체를 새 접시로 옮깁니다. 단일 세포로의 해리는 대부분의 iPSC 라인에서 분화 및 세포사멸을 유발할 수 있으므로 피하십시오. 장기간의 단일 세포 계대 형성은 인간 iPSC의 게놈 변형을 증가시킬 수 있는 것으로 보고되었습니다. 박리 용액을 제거하기 위해 원심분리 단계가 필요한 세포 분리 절차는 iPSC의 전반적인 생존력을 감소시키므로 피하십시오. 모든 배양물에서 미생물 오염, 특히 마이코플라스마를 정기적으로 테스트하면 iPSC의 품질과 분화 능력이 변경될 수 있습니다.
- 제조업체의 지침에 따라 60mm 조직 배양 접시를 EHS 매트릭스로 코팅합니다.
- 1 x 106 human iPSC의 부분 표본을 해동합니다. EHS 매트릭스로 코팅되고 5mL의 배지 A를 함유한 60mm 조직 배양 접시에 iPSC를 파종합니다(재료 표 참조). 배지를 매일 교체하고 세포가 ~ 80 % confluency.
에 도달하면 5-7 일 후에 통과하십시오.
메모: 분화를 시작하기 전에 적어도 한 번은 효소가 없는 콜로니 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 80% 포화도에서 해동된 iPSC를 통과시킵니다. 간단히 말해서, iPSC 배지를 제거하고, 37°C로 예열된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12)로 세포를 한 번 세척한 다음, 시약 A를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 iPSC를 배양합니다(재료 표 참조). 단일 세포로의 해리를 방지하기 위해 권장 배양 시간을 초과하지 마십시오. 인간 iPSC는 단세포가 아닌 응집체로 분리되어 떠다녀야 합니다. 그런 다음 새로운 EHS 매트릭스 코팅 접시로 옮길 수 있습니다. 예를 들어, 하나의 60mm 접시에서 얻은 iPSC 응집체를 4개의 새로운 60mm 접시에 분배할 수 있습니다.
b. 제조업체의 지침에 따라 마이코플라스마 검출 키트로 마이코플라스마를 확인하십시오. 마이코플라스마는 iPSC의 분화 능력을 변화시킬 수 있으므로 마이코플라스마가 없는 iPSC만 사용하십시오.
- iPSC(80% 농도)를 해리하고 시약 B를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
- 예열된(37°C) DMEM/F12로 iPSC를 한 번 세척합니다.
- 예열된 시약 B(예: 60mm 접시에 1mL)를 추가하고 37°C 및 5% CO2에서 5분 동안 iPSC를 배양합니다.
- 접시의 측면과 바닥을 손가락 끝으로 20회 두드려 iPSC를 분리합니다. 현미경으로 세포가 분리되었는지 확인하십시오.
- 1mL 마이크로피펫으로 접시에서 세포 현탁액을 위아래로 5회 피펫팅합니다.
- 배지 A 3mL를 첨가하여 시약 B 1mL를 희석하고 15mL 원심분리 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.
- 실온에서 4분 동안 iPSC(500 x g)를 부드럽게 회전시킵니다.
- 1mL의 배지 B에 세포 펠릿을 재현탁하고 혈구계로 세포 수를 계산합니다.
메모: 재현탁에는 매체 B만 사용한다는 점에 유의하십시오. 매체 A에는 너무 높은 농도의 bFGF가 포함되어 있어 감화를 방해할 수 있으므로 사용을 피하십시오.
- 10μM rho-associated protein kinase inhibitor(Y-27632)가 보충된 배지 B에서 세포 현탁액을 4.5 x 10mL당 5 cells로 희석합니다.
- 비접착성, v-bottom, 96웰 플레이트에 웰당 100μL를 추가합니다.
메모: 100μL 부분을 꺼내기 전에 매번 튜브를 흔들어 세포가 현탁액에 균등하게 분포되어 있는지 확인합니다. 크기와 모양이 균질한 신경구체(둥글고 정의된 표면)를 얻기 위해 각 웰에 등가한 세포 번호가 포함되어야 하는 것이 중요합니다.
- 500 x g 및 실온에서 3분 동안 셀과 함께 플레이트를 부드럽게 회전시키고 37°C 및 5% CO2에서 배양합니다.
- 다음 50일 동안 50μL를 제거하고 50μL의 새로운 배지 B를 각 웰에 추가하여 매일 배지를 교체하십시오.
2. EHS 매트릭스에 신경구 임베딩 (4일)
- 다음을 혼합하여 신경구 배지를 준비합니다: DMEM/F12 및 중간 C(v/v)의 1:1 혼합물, 1:200(v/v) 보충제 1, 비타민 A 없음(w/o) 1:100(v/v) 보충제 2, 1:100 L-글루타민, 0.05mM 비필수 아미노산(MEM), 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신, 1.6g/L 인슐린 및 0.05mM β-메르캅토에탄올.
- 멸균 가위로 미리 자른 ~2mm 팁을 사용하여 200μL 마이크로피펫으로 신경구를 수집합니다.
- 빈 100mm 접시에 파라핀 필름(3 x 3cm2)을 바르고 신경 구체를 서로 약 5mm 떨어진 곳에 놓고 나머지 매체를 가능한 한 많이 조심스럽게 제거합니다.
- EHS 매트릭스 한 방울(7 μL)을 각 단일 신경구에 추가합니다.
- EHS 매트릭스 방울을 인큐베이터에서 15분 동안 신경구와 함께 배양합니다.
- 파라핀 필름에서 신경구체를 신경구체 배지로 세척하여 조심스럽게 씻어냅니다. 세척하려면 1mL 마이크로피펫과 10mL의 신경구 배지가 들어 있는 새 100mm 페트리 접시를 사용합니다.
- 다음 4일 동안 신경구를 배양하고 2.
일차에 2mL의 신선한 신경구 배지를 추가합니다.
메모: EHS 매트릭스가 포함된 신경구가 접시의 한쪽 면에 뭉치지 않도록 인큐베이터의 선반이 평평한지 확인하십시오.
3. 로터리 서스펜션 배양에서의 오가노이드(14일)
- 다음을 혼합하여 뇌 오가노이드 배지를 준비합니다: DMEM/F12 및 배지 C(v/v)의 1:1 혼합물, 1:200(v/v) 보충제 1, 1:100(v/v) 보충제 2 비타민 A 없음, 1:100 L-글루타민, 0.05 mM MEM, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 1.6 g/L 인슐린, 0.5 μM 도르소모르핀, 5 μM SB431542, 및 0.05mM β-메르캅토에탄올.
- 측면 암을 통해 각 스피너 플라스크에 100mL의 브레인 오가노이드 배지를 추가하고 인큐베이터에 넣어 최소 20분 동안 예열합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 25rpm에서 교반 프로그램을 설정하십시오.
메모: EHS 매트릭스가 포함된 신경구를 스피너 플라스크로 옮기기 전에 모두 분리되어 있는지 확인하십시오. EHS 매트릭스를 통해 두 개 이상이 연결된 경우 메스로 연결 매트릭스를 절단하여 분리합니다.
- 2mL 혈청학적 피펫을 사용하여 EHS 매트릭스가 포함된 신경구를 100mL의 오가노이드 배지가 들어 있는 스피너 플라스크로 조심스럽게 옮깁니다. 스피너 플라스크의 측면 암을 사용하여 신경 구체를 플라스크로 이동합니다.
- 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터의 자기 교반 플랫폼에 스피너 플라스크를 놓습니다. 이것은 오가노이드 배양의 0일차입니다.
- 매체의 절반을 제거하고 동일한 양의 새로운 매체를 추가하여 일주일에 한 번(또는 색상 변경이 있는 경우 더 자주) 매체를 변경합니다.
메모: 인큐베이터에서 스피너 플라스크를 꺼낼 때 오가노이드가 플라스크 바닥으로 가라앉을 때까지 3-5분 정도 기다립니다. 액체 표면에 유리 피펫 팁 (펌프에 연결됨)을 놓아 매체를 제거하십시오. 플라스크의 한쪽 개구부/암을 통해 매체를 조심스럽게 흡입합니다. 이러한 조작은 층류 후드 아래에서 수행되어야 합니다.
