전기자극 유도 신경줄기세포와 전구세포의 분화

초록

출처: Chang, H. et al., Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices.J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 전기 자극을 통해 신경 줄기 및 전구 세포 또는 NPC를 구별하기 위해 세포 외 매트릭스로 코팅된 미세유체 칩을 사용하는 방법을 보여줍니다. 코팅된 부위에 파종하고 부착한 후 NPC는 성장하고 직류를 가하면 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포로 분화됩니다.

프로토콜

1. 다중 채널, 광학적으로 투명, 전기 전술 (MOE) 칩의 설계 및 제작

1. 적절한 소프트웨어를 사용하여 개별 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 층과 양면 테이프에 대한 패턴을 그립니다(그림 1A, 재료 표). CO₂ 레이저 기계 스크라이버로 PMMA 시트와 양면 테이프를 모두 자릅니다(그림 1B).
   1. CO₂ 레이저 스크라이버를 켜고 개인용 컴퓨터에 연결합니다. 소프트웨어를 사용하여 설계된 패턴 파일을 엽니다.
   2. PMMA 시트(275mm x 400mm) 또는 양면 테이프(210mm x 297mm)를 레이저 스크라이버의 플랫폼에 놓습니다(그림 2A). 자동 초점 도구를 사용하여 PMMA 시트 또는 양면 테이프의 표면에 레이저의 초점을 맞춥니다.
   3. 레이저 스크라이버를 프린터로 선택한 다음 레이저 스크라이버를 사용하여 패턴을 "인쇄"하여 PMMA 시트 또는 양면 테이프에서 직접 절제를 시작하고 PMMA 시트 또는 테이프에서 개별 패턴을 얻습니다(그림 2B).
2. PMMA 시트에서 보호 필름을 제거하고 질소 가스를 사용하여 표면을 청소합니다.
   메모: PMMA 패턴의 도면 및 PMMA 시트의 직접 가공은 이전 보고서에 따라 수행되었습니다.
3. PMMA 시트의 여러 층을 함께 접착하려면 1mm PMMA 시트 3개(레이어 1, 2 및 3)를 쌓고 110°C에서 30분 동안 열 접착기에 5kg/cm²의 압력으로 접착하여 흐름/전기 자극 채널 어셈블리를 형성합니다(그림 2C).
   메모: 상업적으로 입수된 PMMA 시트의 배치에 따라 유리 전이 온도(Tg)가 약간 다릅니다. 최적의 접합 온도는 Tg에 가까운 5°C 단위로 테스트해야 합니다.
4. 속효성 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 MOE 칩 어셈블리의 레이어 1에 있는 개별 개구부에 12개의 어댑터를 부착합니다.
   메모: 어댑터는 사출 성형으로 PMMA로 만들어집니다. 하단의 평평한 표면은 MOE 칩에 연결하기 위한 것입니다. 1/4W-28 암나사산이 있는 어댑터는 흰색 손가락으로 조이는 플러그, 평평한 바닥 커넥터 또는 Luer 어댑터를 연결하기 위한 것입니다. 속효성 시아노아크릴레이트 접착제를 사용할 때 주의하십시오. 눈에 튀지 마십시오.
5. 칩을 조립하기 전에 자외선(UV) 조사를 사용하여 1mm PMMA 기판(레이어 1-3), 양면 테이프(레이어 4) 및 3mm 광학 등급 PMMA(레이어 5)를 30분 동안 소독합니다(그림 1A).
6. 양면 테이프(레이어 4)를 사용하여 3mm 광학 등급 PMMA(레이어 5)에 1mm PMMA 기판(레이어 1-3)을 부착하여 PMMA 어셈블리(레이어 1-5)를 완성합니다(그림 1A).
7. 칩의 어셈블리를 위해 깨끗한 커버 유리를 준비합니다.
   1. 염색 용기에 세제를 10배 희석한 용액을 채우고(재료표 참조) 초음파 세척기를 사용하여 이 세제의 커버 유리를 15분 동안 청소합니다.
   2. 흐르는 수돗물에 얼룩 항아리를 철저히 헹구어 세제의 흔적을 모두 제거합니다.
   3. 증류수로 계속 헹구어 수돗물의 흔적을 모두 제거하고 1.7.2단계를 두 번 반복합니다.
   4. 청소한 커버 유리에 질소 가스를 불어
   건조시킵니다.
8. 칩을 조립하기 전에 생물 안전 캐비닛 내부에서 UV 조사를 사용하여 PMMA 어셈블리(레이어 1-5), 양면 테이프(레이어 6) 및 커버 유리(레이어 7)를 30분 동안 소독합니다(그림 1A).
9. 청소한 커버 유리(레이어 7)를 양면 테이프(레이어 6)를 사용하여 PMMA 어셈블리(레이어 1-5)에 부착합니다(그림 1A).
10. MOE 칩을 진공 챔버에서 하룻밤 동안 배양하고 후속 절차에는 MOE 칩 어셈블리를 사용합니다(그림 3).

2. 세포 배양 영역의 기질에 폴리-L-라이신(PLL) 코팅

1. 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브, 평평한 바닥 커넥터, 콘 커넥터, 콘 루어 어댑터, 흰색 손가락 조임 플러그(스토퍼라고도 함), 루어 어댑터, 루어 잠금 주사기 및 검은색 고무 마개를 준비합니다(그림 4A, 재료 표). 위의 모든 구성 요소를 121°C의 오토클레이브에서 30분 동안 멸균합니다.
2. 한천 브리지 어댑터(그림 1A)의 개구부를 흰색 손가락으로 조이는 플러그로 밀봉합니다. 매체 입구 및 출구 어댑터를 통해 평평한 바닥 커넥터를 MOE 칩 어셈블리에 연결합니다(그림 4B). 콘-루어 어댑터를 3방향 스톱콕에 연결합니다.
3. 매체 주입구의 3방향 스톱콕에 연결하는 3mL 주사기를 사용하여 0.01% PLL 용액 2mL를 추가합니다(그림 4B-).
4. 빈 3mL 주사기를 매체 배출구의 3방향 마개에 연결합니다(그림 4B-).
5. 세포 배양 영역을 PLL 용액으로 채웁니다. 코팅 용액을 수동으로 천천히 앞뒤로 펌핑하십시오. 두 개의 3방향 마개를 닫아 배양 영역 내부에 용액을 밀봉합니다.
6. 5% CO₂ 기압으로 채워진 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 MOE 칩을 배양합니다.

3. 소금교 네트워크 준비

1. 2.6단계에 따라 두 개의 3방향 스톱콕을 열고 두 개의 주사기를 사용하여 채널에서 코팅 용액을 앞뒤로 수동으로 펌핑하여 채널의 기포를 씻어냅니다.
2. 3mL의 완전한 배지(Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지/Ham의 영양 혼합물 F-12(DMEM/F12), 2% B-27 보충제, 20ng/mL EGF 및 20ng/mL bFGF로 구성된 줄기세포 유지 배지)를 배지 주입구의 3방향 마개에 연결하는 3mL 주사기에 추출합니다(그림 4B- 및 그림 4B- ).
3. 세포 배양 영역에서 코팅 용액을 대체하기 위해 3mL의 완전한 배지를 추가합니다. 빈 5mL 주사기를 매체 배출구의 3방향 마개에 연결합니다(그림 4B-).
4. 염교 네트워크를 준비합니다(그림 5).
   1. 검은색 고무 마개를 잘라 틈을 만들고 검은색 고무 마개를 통해 은(Ag)/염화은(AgCl) 전극을 Luer 잠금 주사기에 삽입합니다(그림 4A).
   2. 흰색 핑거타이 플러그를 Luer 어댑터로 교체하고 뜨거운 아가로스 3%를 주입하여 Luer 어댑터를 채웁니다.
      메모: 뜨거운 아가로스를 준비하기 위해 아가로스 분말 3g을 인산염 완충 식염수(PBS) 100mL에 녹이고 121°C의 오토클레이브에서 30분 동안 살균합니다.
   3. Luer 잠금 주사기를 Luer 어댑터에 연결합니다. 검은색 고무 마개를 통해 3%의 뜨거운 아가로스를 주입하여 주사기를 바늘로 사용하여 Luer Lock 주사기를 채웁니다. 아가로스가 식고 굳을 때까지 10-20분 정도 기다립니다.
      메모: 아가로스의 부피 용량을 증가시키기 위해 Luer lock 주사기가 Luer 어댑터에 장착됩니다(그림 4 및 그림 5). 그런 다음 큰 전극을 Luer Lock 주사기에 삽입합니다. 전극은 장기 실험을 위해 안정적인 전기 자극을 제공할 수 있습니다.

4. mNPC 준비

1. 5% CO₂ 분위기로 채워진 인큐베이터에서 37°C의 25T 세포 배양 플라스크에서 완전한 배지의 mNPC를 배양합니다. 3-4일마다 세포를 계대배양하고 원래 소스에서 3-8개의 계대를 거친 세포로 모든 실험을 수행합니다.
2. 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 100 × g에서 5분 동안 신경구를 스핀다운합니다.상층액을 흡인하고 1x Dulbecco의 PBS(DPBS)로 신경구를 세척합니다. 100 × g에서 5분 동안 신경구를 스핀다운합니다.
3. 1x DPBS를 흡인하고 완전한 배지에서 신경구를 다시 부유시킵니다. 철저하고 부드럽게 섞습니다.
4. 배출구의 3방향 마개에 연결하는 1mL 주사기를 사용하여 신경구 현탁액 1mL를 추가합니다(그림 4B-).

5. DC 펄스 자극을 위한 미세유체 시스템 설정(그림 6)

1. 프로그래밍 가능한 X-Y-Z 전동 스테이지에 고정된 투명 ITO(Indium-Tin-Oxide) 히터에 셀 시드 MOE 칩을 설치합니다.
   메모: ITO 표면 온도는 비례-적분-미분 컨트롤러에 의해 제어되며 37°C로 유지됩니다. K형 열전대는 칩과 ITO 히터 사이에 고정되어 칩 내 세포 배양 영역의 온도를 모니터링합니다. MOE 칩은 프로그래밍 가능한 X-Y-Z 전동 스테이지에 설치되며 개별 채널 섹션에서 자동 타임 랩스 이미지 획득에 적합합니다. ITO 히터의 제작 및 세포 배양 가열 시스템의 설정은 이전에 설명되었습니다.
2. 매체 배출구를 통해 MOE 칩에 수동 펌핑하여 mNPC를 주입합니다. cell-seeded MOE 칩을 37°C ITO 히터에서 4시간 동안 배양합니다.
3. 4시간 후 주사기 펌프를 사용하여 20μL/h의 유속으로 매체 주입구를 통해 MOE 칩을 통해 전체 매체를 펌핑합니다.
   메모: mNPC는 세포 부착 및 성장을 허용하기 위해 전기장(EF) 자극 전에 추가로 24시간 동안 칩에서 성장 및 유지됩니다. 폐액은 그림 5A에서 "폐기물"로 표시된 배출구의 3방향 마개에 연결된 빈 6mL 주사기에 수집됩니다. MOE 미세유체 시스템 구성은 그림 6에 나와 있습니다. 이 미세유체 시스템은 세포에 영양을 지속적으로 공급합니다. 완전한 신선 매체는 일정한 pH 값을 유지하기 위해 MOE 칩으로 지속적으로 펌핑됩니다. 따라서 세포는 CO₂ incubator 외부에서 배양할 수 있습니다.
4. 전선을 사용하여 칩의 Ag/AgCl 전극을 통해 EF 멀티플렉서를 MOE 칩에 연결합니다. EF 멀티플렉서와 함수 발생기를 증폭기에 연결하여 50% 듀티 사이클(50% 타임온 및 50% 타임오프)에서 100Hz의 주파수에서 300mV/mm 크기의 구형파 DC 펄스를 출력합니다(그림 6B).
   1. 전선을 EF 멀티플렉서에 연결합니다. Ag/AgCl 전극을 통해 전선을 MOE 칩에 연결합니다.
   2. EF 멀티플렉서를 amp전선을 사용하여 liifier. 함수 발생기를 ampliifier와 디지털 오실로스코프.
      메모: EF 멀티플렉서는 회로에 배양 챔버의 임피던스를 포함하고 병렬 전자 네트워크의 모든 개별 챔버를 연결하는 회로입니다. 3개의 배양 챔버 각각은 멀티플렉서의 가변 저항기(Vr) 및 전류계(그림 6A에서 μA로 표시)에 직렬로 전기적으로 연결됩니다. 각 배양실을 통과하는 전류는 Vr을 제어하여 변화시키며, 전류는 해당 전류계에 표시됩니다. 각 세포 배양 영역의 전기장 강도는 옴의 법칙 I= σEA에 의해 계산되었으며, 여기서 I는 전류, σ(DMEM/F12의 경우 1.38 S·^m-1로 설정)는 배양 배지의 전기 전도도, E는 전기장, A는 전기 전술 챔버의 단면적입니다. 그림 1에 표시된 세포 배양 영역 치수의 경우 전류는 50% 듀티 사이클에서 DC 및 DC 펄스의 경우 각각 ~87mA 및 ~44mA입니다.
5. mNPC를 48시간 동안 100Hz의 주파수에서 300mV/mm 크기의 제곱 DC 펄스에 적용합니다. 전체 배지를 10μL/h의 속도로 지속적으로 펌핑하여 세포에 적절한 영양을 공급하고 배지에서 일정한 pH 값을 유지합니다.

결과

그림 1: 다중 채널 광학 투명 전기 전술 칩의 세부 구성.(A) MOE 칩 어셈블리의 폭발 보기. MOE 칩은 PMMA 시트(50mm x 25mm x 1mm), 양면 테이프(50mm x 25mm x 0.07mm), 어댑터(10mm x 10mm x 6mm), 광학 등급 PMMA 시트(50mm x 75mm x 3mm), 양면 테이프(24mm x 60mm x 0.07mm)로 구성됩니다. 및 커버 유리(24mm × 60mm). MOE 칩에는 3개의 세포 배양 챔버가 있습니다. MOE 칩에는 매체 입구/출구와 한천 소금 브리지를 위한 연결 구멍이 있습니다. 세포 배양 영역(폭 3mm x 길이 42mm x 높이 0.07mm)에서 세포를 배양하였다. (B) 어댑터, P...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1mm PMMA 기판(레이어 1-3)	비에이치티	K2R20	폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL 플라스틱 튜브	Protech 기술 기업 Co., 주식 회사	코네티컷-15-PL-TW	캡이 있는 원추형 바닥 튜브, 조립, 사전 멸균
3 mL 주사기	데루모	DVR-3413	3mL 구강 주사기, 바늘 없음
3mm 광학 등급 PMMA(레이어 5)	주식회사 CHI MEI	ACRYPOLY PMMA 시트	광학 등급 PMMA
3방향 스톱콕	니프로	NCN-3L	멸균 일회용 3방향 스톱콕
5mL 주사기	데루모	DVR-3410	5mL 구강 주사기, 바늘 없음
어댑터	공급자:Dong Zhong Co., Ltd.	주문을 받아서 만들어진	PMMA 어댑터
아가로스	시그마-알드리치	A9414	아가로스, 낮은 겔화 온도
증폭기	AA 랩 시스템 회사	가-304	고전압 증폭기
AutoCAD 소프트웨어	오토데스크	교육용 버전	제도
B-27 보충제	지브코	제12587-010	B-27 보충제(50개), 비타민 A 제외
염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)	페프로텍	AF-100-18B	재조합 인간 FGF-basic이라고도 합니다.
검은색 고무 마개	데루모	DVR-3413	바늘 없이 3mL 구강 주사기에서
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	B4287	차단 시약
원심 분리기	샹타이	이력서2060	원심 분리기
CO2 레이저 스크라이버	레이저 도구 및 기술 공사	ILS-II	에서 구입 http://www.lttcorp.com/index.htm
원뿔 커넥터	IDEX 건강 & 과학	F-120X	일체형 핑거타이트 10-32 콘, 1/16" OD 내추럴
콘-루어 어댑터	IDEX 건강 & 과학	P-659	루어 어댑터 10-32 암-암 루어, PEEK
컨포칼 형광 현미경	라이카 마이크로시스템즈	TCS SP5	라이카 TCS SP5 사용자 매뉴얼, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
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둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)	지브코	21600010	DPBS, 분말, 칼슘 없음, 마그네슘 없음
EF 멀티플렉서	공급자:Asiatic Sky Co., Ltd.	주문을 받아서 만들어진	개별 채널의 전류를 모니터링하고 제어합니다.
표피 성장 인자(EGF)	페프로텍	AF-100-15	재조합 인간 EGF라고도 합니다.
속효성 시아노아크릴레이트 접착제	3엠	7004톤	강도 : 순간 접착제 (액체)
평평한 바닥 커넥터	IDEX 건강 & 과학	P-206	플랜지가 없는 수 너트 Delrin, 1/4-28 플랫 바텀, 1/16" OD 블루용
함수 생성기	애질런트 테크놀로지스	33120ᅡ	임의 파형 기능이 내장된 고성능 15MHz 합성 함수 발생기
인듐-주석-산화물(ITO) 유리	머 크	300739	ITO 히터용
K형 열전대	테펠	티피-02ᅡ	온도 열전대
루어 어댑터	IDEX 건강 & 과학	P618-01	Luer 어댑터 암 Luer 1/4-28 남성 폴리프로필렌
루어 락 주사기	데루모	DVR-3413	한천 소금 다리의 경우
인산염 완충 식염수(PBS)	기본 생활	BL2651	세척 용액
폴리-L-라이신(PLL)	시그마	P4707	코팅 용액
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비례-적분-미분(PID) 컨트롤러	(주)토호일렉트로닉스	TTM-J4-R-AB	온도 조절기
PTFE 튜브	Professional Plastics Inc. 대만 지사	외경 1/16 인치	백색 반투명 PTFE 튜브
주사기 펌프	뉴 에라 시스템 Inc	재질 보기 NE-1000	NE-1000 프로그래밍 가능한 단일 주사기 펌프
TFD4 세제	프랭크랩	에프디4	커버 유리 세정제
열 본더	Kuan-MIN 테크 Co.	주문을 받아서 만들어진	에서 구매 http://kmtco.com.tw/
초음파 세척기	레오	레오-300S	초음파 steri 세탁기술자
진공 챔버	공급자:DENG YNG INSTRUMENTS CO., LTD.	도브-30	진공 건조 오븐
흰색 핑거타이트 플러그	IDEX 건강 & 과학	P-316	1/4-28 플랫 바텀, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html