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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
그림 1은 이 프로토콜의 워크플로우에 대한 개략적인 개요를 보여줍니다.
1. iPSC 재프로그래밍 및 유지 보수
- 피험자(노인 또는 질병 환자, 65세 이상)의 혈액 8mL를 시트르산나트륨이 함유된 세포 준비 튜브(CPT) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 헤파린 튜브에 수집합니다.
- 실온(RT)에서 30분 동안 1,800 x g의 원심분리기를 사용하여 말초 혈액만 포함하고 혈청은 포함하지 않는 펠릿을 수집합니다.
- 제조업체의 프로토콜(재료 표 참조)에 따라 특수 재프로그래밍 벡터를 사용하여 iPSC를 얻을 수 있습니다.
- 피더가 없는 유당 탈수소효소 상승 바이러스(LDEV)가 없는 성장 인자 감소 기저막 매트릭스에서 5%CO2가 있는 가습 분위기에서 37°C의 Essential 8(E8) 배지(재료 표 참조)로 코팅된 6웰 배양 플레이트에서 iPSC를 배양합니다.
- E8 배지에서 iPSC를 3-4일 동안 유지하여 과밀 또는 자발적인 분화를 방지합니다.
- 면역형광 마커를 사용하여 iPSC 라인의 다능성을 검증하고(2단계) 마이코플라스마를 테스트합니다(3단계).
2. 만능 염색
- 용액과 항체를 보존하려면 분석 3-4일 전에 코팅된(단계 1.4) 24웰 배양 플레이트에 세포를 파종합니다. 피펫으로 배지를 흡인하고 RT에서 15-20분 동안 인산염 완충 식염수(1x PBS)에 4% 포름알데히드로 세포를 고정합니다.
- 1x PBS로 세포를 3x 세척하고 PBS에서 1% 소 혈청 알부민(BSA)에 0.1% Triton-X 100으로 최소 15분 동안 투과화하지만 RT에서 1시간 이상 투과하지 않습니다.
- 1x PBS로 3x 세척하고 RT에서 30분 동안 PBS에서 5% BSA로 차단합니다.
- 1x PBS로 다시 3회 세척하고 항체 Sox2 및 Oct3/4(1:100 희석, 재료 표 참조)와 핵 염색 DAPI를 4°C에서 하룻밤 동안 1% BSA(1:4,000 희석)에 추가합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싸십시오.
- 1x PBS로 3x 세척하고 세포를 PBS에 그대로 둡니다. 10-20x 배율의 형광 현미경을 사용한 이미지. 다능성 마커, 성 결정 영역, Y-box 2(Sox2) 및 옥타머 결합 전사 인자 3/4(Oct3/4)가 세포핵에 국한되어 있는지 확인합니다.
3. 마이코플라스마 테스트
참고: 자세한 분석 실행 및 분석 단계는 검출 키트의 프로토콜(재료 표 참조)을 참조하십시오. 검출 키트는 마이코플라스마 검사를 위한 시약, 기질 및 분석 버퍼를 제공합니다.
- 세포 또는 리프레시 배지를 전달하기 전에 원심분리 튜브에 2-3mL의 세포 배양 배지를 수집하고 RT에서 5분 동안 200 x g에서 세포 또는 파편을 펠릿화합니다. 상등액을 4°C에서 ≤5일 동안 보관합니다. 검출 가능한 신호를 보장하기 위해 최소 24시간 동안 배지와 함께 세포를 배양합니다.
- 100μL의 세포 상층액을 흰색 벽의 96웰 플레이트의 새 튜브 또는 웰에 추가합니다(불투명한 바닥 권장, 재료 표 참조). 분석 버퍼에서 시약과 기질을 재구성하고 RT에서 15분 동안 평형을 이룹니다.
- 샘플에 시약 100μL를 추가하고 RT에서 5분 동안 배양합니다. 광도계(측정 #1)로 발광을 측정합니다.
- 시료에 100μL의 기판을 추가하고 RT에서 10분 동안 배양합니다. 발광을 측정합니다(측정 #2).
- 측정 #2 대 #1의 비율로 마이코플라스마 오염을 측정합니다. 결과 해석을 위해 키트의 설명서를 참조하십시오.
4. 마이크로 필라멘트 준비
- 메스의 뭉툭한 끝으로 봉합사 가닥을 닳게 하여 폴리(젖산-코글리콜산)(PLGA, 재료 표 참조) 미세필라멘트의 준비를 시작합니다. 닳은 섬유를 70% 에탄올로 가볍게 중성화합니다.
- 현미경 아래에서 자를 사용하여 PLGA 광섬유를 500μm에서 1mm 길이의 가닥 조각으로 절단하기 시작합니다. 총 25mm 정도의 섬유를 자릅니다. 필라멘트를 15mL 항생제-항진균 용액이 있는 1mL 튜브에 보관하십시오.
- 후드에서 섬유 용액을 10mL의 DMEM/F-12로 희석합니다(표 1). 소용돌이가 용액을 잘 혼합합니다 .
메모: 멸균 환경의 세포 배양 흐름 후드에서 작업하십시오.
- 20μL의 섬유 용액을 96웰 플레이트의 웰을 형성하는 3개의 배아체(EB)에 추가합니다. 명시야 현미경 검사에서 웰당 섬유를 세고 평균을 냅니다. 웰당 평균 5-10 PLGA 마이크로필라멘트로 희석 또는 농축합니다. 이런 식으로 각 우물을 준비하십시오.
- 이제 우물에는 세포를 심을 준비가 되었습니다. 필요할 때까지 접시를 실온에 보관하거나 다음 날에는 4°C에서 보관하십시오.
5. 배아체(EB) 형성
참고: 모든 미디어와 용액은 RT로 예열되어야 합니다.
- iPSC가 70%-80% 포화도에 도달하면(그림 2A) 배후를 통해 EB 형성에 사용할 준비가 된 것입니다. 10x-20x 배율에서 현미경으로 세포를 확인합니다. 군체가 자발적 분화의 최소한(<10%) 영역을 나타내도록 합니다.
- 피펫으로 배지를 흡인하고 Dulbecco의 DPBS(Phosphate-Buffered Saline)로 세포를 한 번 세척합니다. 500μL의 세포 분리 용액(재료 표 참조) 또는 0.5mM의 EDTA를 첨가하여 콜로니를 해리하고 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다.
메모: 멸균 환경의 세포 배양 흐름 후드에서 작업하십시오.
- 각 웰에 1mL의 새로운 E8 배지를 추가하여 방출된 세포를 수집하고 모든 세포가 분리될 때까지 부드럽게 피펫팅합니다.
- 1.5mL의 세포 현탁액을 15mL 튜브에 옮기고 1mL의 새로운 E8 배지를 더 추가하여 총 부피 2.5mL에 도달합니다.
- 290 x g에서 상온에서 3분 동안 원심분리기.
- 피펫으로 상층액을 흡인하고, 50μM Rho-associated protein kinase(ROCK) 억제제가 보충된 1mL의 Essential 6(E6, 재료 표 참조) 배지에 세포 펠렛을 재현탁하고, 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
- 50μM의 ROCK 억제제가 보충된 E6 배지에서 원하는 시딩 밀도에 따라 60,000-90,000 cells/mL의 세포 현탁액을 준비합니다(재료 표 참조).
- 150μL의 세포 현탁액을 96웰 ULA(Ultra-Low Attachment) 플레이트(또는 준비된 오목한 플레이트)의 각 웰에 추가합니다. 웰당 9,000-11,000개의 세포를 파종합니다.
- 플레이트를 원심분리하여 RT에서 1분 동안 290 x g에서 세포를 강제 응집합니다.5% CO2로 가습된 분위기에서 37°C의 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.
6. 신경 상피 유도
- 24시간 후 피펫으로 배지 120μL를 조심스럽게 흡입합니다. 피펫 팁을 웰 안으로 너무 멀리 내려 EB를 흡인하지 않도록 하십시오.
- 2μM의 XAV939가 보충된 150μL의 E6 배지(RT에서)와 Decapentaplegic(SMAD) 억제제에 대한 산모 억제제(웰당 10μM의 SB431542 및 500nM의 LDN 193189)를 추가합니다(재료 표 참조).
- 2μM의 XAV939, 10μM의 SB431542 및 500nM의 LDN 193189.
가 보충된 갓 준비된 E6 배지로 배지를 매일 교체하십시오.
메모: 6일차(DIV6)까지 EB는 직경이 550-600μm여야 하며 추가 분화가 가능해야 합니다.
7. 오가노이드 분화 및 성숙
참고: 모든 미디어는 RT로 워밍업해야 합니다.
- 대략 DIV7에서 모든 EB가 550-600 μm의 직경에 도달했는지 확인하고 매끄럽고 명확한 가장자리를 표시합니다(그림 2B). 이 단계에서는 세포외 기질(ECM)에 내장할 준비가 된 것입니다.
메모: 멸균 환경에서 작업하십시오.
- 빈 P200 상자에 필름 시트(약 4인치 길이)를 올려 열가소성 밀봉 필름(재료 표 참조)에서 딤플 임베딩 시트를 준비합니다. 15mL 원뿔형 튜브 또는 500μL 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하여 필름 시트를 구멍에 부드럽게 눌러 12개의 딤플을 만듭니다. 필름 시트에 70% 에탄올을 뿌리고 UV 광선을 켠 상태에서 플로우 후드 내부에서 최소 30분 동안 건조시킵니다.
- 얼음 위에 충분한 양의 기저막 매트릭스(Matrigel, 재료 표 참조)를 해동하고 플로우 후드 내부에 넣습니다.
메모: EB당 약 30μL의 희석되지 않은 멤브레인 매트릭스가 필요합니다. 겔화되는 것을 방지하기 위해 항상 멤브레인 매트릭스를 4°C 미만으로 유지하십시오. 사전 냉각된 피펫 팁도 피펫팅 중 팁에서 매트릭스가 중합되는 것을 감속하여 재료 손실을 줄이기 때문에 권장됩니다.
- 구경이 넓은 P200 팁을 사용하여 각 딤플에 EB 하나를 옮기고 일반 피펫 팁으로 가능한 한 많은 매체를 제거합니다. EB가 건조되지 않도록 주의하십시오. 일반 P200 팁을 사용하여 ~30μL의 희석되지 않은 멤브레인 매트릭스를 각 오가노이드에 추가하여 EB가 액적의 중심에 있도록 합니다.
- 모든 EB가 매트릭스에 삽입되면 EB가 포함된 필름 시트를 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
메모: 선택적으로, 멸균수로 채워진 작은 페트리 접시를 필름 시트 옆에 있는 더 큰 페트리 접시에 넣어 증발을 방지할 수 있습니다.
- 접시를 인큐베이터로 옮기고 37°C에서 5% CO2로 가습된 분위기에서 약 10분 동안 배양하여 멤브레인 매트릭스가 응고되도록 합니다.
- 12개의 내장된 오가노이드 각 세트에 대해 ULA 6웰 플레이트의 한 웰에 비타민 A가 없는 B27이 포함된 5mL의 분화 배지(표 1)를 준비합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 37 °C로 예열합니다.
- 배양 시간이 끝나면 필름 시트를 취하고 시트 뒤쪽에서 딤플을 밀어내어 내장된 EB를 ULA 6웰 플레이트로 옮깁니다. 필요한 경우 웰에서 1mL를 꺼내 시트에 피펫으로 코팅하여 필름에서 물방울을 분리할 수 있도록 합니다.
메모: 중요한 형태학적 변화는 삽입 후 1일 후에 볼 수 있습니다. EB는 가장자리가 매끄러워지는 것에서 새싹을 형성하는 돌출부로 이동합니다(그림 2C).
- 2일(DIV9) 후 절반 미디어 변경을 수행합니다. 이 과정에서 멤브레인 매트릭스 방울을 흡인하거나 손상시키지 않도록 주의하십시오.
- 2일 후(DIV11) 전체 배지 교체를 수행하여 배지에 3μM의 CHIR99021 추가합니다(재료 표 참조).
- DIV14에서 배지를 비타민 A가 포함된 B27(표 1)로 분화 배지로 변경하여 오가노이드 크기를 점진적으로 증가시킵니다.
- DIV16에서 웰 플레이트를 인큐베이터 내부의 90rpm으로 오비탈 쉐이커에 놓습니다. 2일마다 미디어를 교체하십시오.
- 매 40 DIV마다 배지 50mL당 멤브레인 매트릭스 500μL를 희석하여 배지에 추가 영양소를 공급합니다.
표 1: 본 연구에서 사용된 분화 매체의 구성.
| 시약 | 최종 집중 | 용량(총 50 mL) |
| DMEM-F12 | 50% | 25 밀리리터 |
| Neurobasal 배지 | 50% | 25 밀리리터 |
| N2 보충제 (100개) | 1배 | 0.25 밀리리터 |
| B27 보충제 -/+ 비타민 A (50배) | 0.5배 | 0.5 밀리리터 |
| 인슐린 | 0.25% | 12.5 μL |
| 글루타맥스 (100배) | 1배 | 0.5 밀리리터 |
| MEM-NEAA(100배) | 0.5배 | 0.25 밀리리터 |
| 헤페스 (1M) | 10 밀리미터미터 | 0.5 밀리리터 |
| 항생제/항진균제(100개) | 1배 | 0.5 밀리리터 |
| 2-β-메르캅토에탄올 | 50 마이크로미터 | 17.5 μL |
| 참고: 일부 DMEM-F12에는 이미 GlutaMAX가 포함되어 있으므로 추가로 추가할 필요가 없습니다. |
