미세유체 소자(microfluidic device)를 이용한 신경근접합부 생성

초록

출처: Stoklund Dittlau, K. et al., 미세유체 장치에서 기능적 신경근 접합부가 있는 인간 운동 단위 생성.J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 미세유체 장치를 사용하여 신경근 접합부의 형성을 보여줍니다. 신경 전구 세포와 근육 전구 세포는 장치 내의 다른 웰에 파종되고 각각 운동 뉴런과 근관으로 성숙하도록 방치됩니다. 부피와 화학적 구배의 생성은 활성 신경근 접합부의 발달로 이어집니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

이 프로토콜에 사용되는 모든 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있으며 멸균 상태로 사용해야 합니다. 미디어는 달리 명시되지 않는 한 사용하기 전에 실온(RT)으로 가열해야 합니다. 공동 배양 프로토콜에 대한 개요는 그림 1을 참조하십시오.

1. 유도만능줄기세포(iPSC)와 운동 뉴런 전구세포의 분화

1. 이전 연구에서 채택된 운동 뉴런 분화 프로토콜을 따라 10일차 신경전구세포(NPC) 상태에 도달할 때까지 따릅니다. 프로토콜의 기간에 따라 차별화는 월요일(0일차)에 시작되며, 그 결과 목요일에 10일차 NPC가 발생합니다.
2. 10일차 NPC를 바이알당 2 x 10⁶- 4 x 10⁶ 세포의 밀도에서 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 녹아웃 혈청 교체에 동결 보존합니다.
   주의: DMSO는 독성이 있습니다: 개인 보호 장비와 함께 흄 후드를 취급하십시오.
   참고: 하루 10명의 NPC 중 약 50%가 해동 시 매우 중요할 것으로 예상됩니다. 이 '10일차 NPC' 상태에서 운동 뉴런 분화 프로토콜을 중지하고 NPC를 동결 보존하여 많은 수의 NPC를 생성하며, 이를 저장하여 나중에 사용할 수 있으므로 공동 배양 프로토콜의 전체 타임라인 길이를 총 28일에서 19일로 단축할 수 있습니다.

2. 인간 중혈관 아세포(MAB)의 유도 및 유지

참고: MAB는 혈관 관련 중간엽 줄기세포로, 이 경우 58세의 건강한 기증자로부터 얻은 생검에서 채취한 것입니다. 대체 상업 소스를 사용할 수 있습니다. MAB를 얻기 위한 프로토콜에 대해 간략하게 설명합니다. 자세한 내용은 세부 프로토콜을 참조하십시오. 모든 MAB 매체는 사용하기 전에 37°C로 가열해야 합니다.

1. 생검 조직을 다지고 성장 배지(표 1)에서 6cm 코팅된 콜라겐(송아지 가죽)을 2주 동안 배양합니다. 4일마다 매체를 교체하십시오.
   1. 콜라겐 코팅을 준비하려면 0.1M 아세트산 20mL에 콜라겐 100mg을 용해시킵니다. 콜라겐이 녹는 데 시간이 걸리므로 RT에서 하룻밤 동안 흔들리는 플랫폼에 혼합물을 놓습니다. 다음 날, 80mL의 ddH₂O를 최종 부피 100mL까지 보충합니다.
      주의: 아세트산은 독성이 있습니다. 개인 보호 장비와 함께 흄 후드를 다루십시오.
      메모: 송아지 가죽 코팅의 콜라겐은 최대 5배까지 재사용할 수 있습니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   2. 접시 또는 플라스크의 전체 표면을 콜라겐으로 코팅하고 닫고 층류 내부의 RT에서 20분 동안 배양합니다. 20분 후, 새 용기에서 콜라겐을 회수하고 빈 접시/플라스크를 닫은 다음 층류의 RT에서 10분 동안 그대로 둡니다.
   3. 접시/플라스크를 인큐베이터로 옮겨 하룻밤(또는 최소 6시간) 배양(37°C, 5% CO₂)을 수행합니다. 세포를 플레이팅하기 전에 칼슘 또는 마그네슘이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 5x 세척합니다.
2. 14일 후, FACS(Fluorescent Activated Cell Sorting)는 인간 알칼리성 포스파타아제에 대한 MAB를 분류한 후 추가 증식을 수행합니다. 성장 배지에서 콜라겐으로 코팅된 T75 플라스크의 MAB를 유지하고 2일마다 성장 배지를 교체합니다(플라스크당 10mL).
3. 70% confluence에 도달할 때 장치에서 극저온 보존, 통과 또는 시딩 MAB를 보존합니다.
   메모: MAB는 세포 간 접촉 시 자발적인 융합으로 인해 근육 전위를 잃습니다. MAB를 확장할 때 70% 합류점을 초과하지 않도록 합니다. 하나의 70% confluent T75 플라스크에는 약 600,000-800,000개의 세포가 포함되어 있으며, 이는 바이알당 100,000개의 세포로 동결 보존될 수 있습니다. 각 바이알은 나중에 해동하고 팽창을 위해 T75 플라스크에 파종할 수 있습니다.
4. MAB를 계대에 계대시키려면 7mL의 DPBS로 한 번 부드럽게 세척한 다음 7mL의 MAB 해리 용액에서 37°C에서 5% CO₂로 3분 동안 배양하여 세포를 해리합니다.
   1. 7mL의 성장 배지로 MAB 해리 용액을 중화하고, 세포를 부드럽게 긁어내고, 세포 현탁액을 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 여분의 성장 배지 5mL로 플라스크를 부드럽게 세척하여 잠재적으로 남아 있는 MAB를 수집합니다.
   2. 300 x g에서 3분 동안 세포 현탁액을 원심분리한 다음 확장을 위해 새로운 콜라겐 코팅된 T75 플라스크로 직접 통로를 이동하고, 10% DMSO로 녹아웃 혈청 대체품에서 냉동 보존하거나 미세유체 장치에서 시드를 계산합니다.
      참고: 계대는 최대 계대 수가 13이 될 때까지 세포 확장을 위해 주당 1x-2x 수행됩니다. 해리 시 MAB는 현미경으로 검사할 때 구형이고 큰 모양으로 나타납니다.

3. 사전 조립된 미세유체 장치의 준비 - 9일차

참고: 이 프로토콜은 미세유체 장치 제조업체의 뉴런 장치 프로토콜에서 조정되었으며 사전 조립된 장치와 실리콘 장치 모두를 사용하도록 조정되었습니다. 여기서 사전 조립된 장치는 면역세포화학(ICC) 및 라이브 셀 칼슘 과도 기록에 사용되는 반면, 실리콘 장치는 주사 전자 현미경(SEM)에 사용됩니다. 프로토콜의 타임라인은 운동 뉴런 분화 프로토콜의 타임라인을 따릅니다.

1. 코팅은 밤새 배양해야 하므로 세포를 파종하기 하루 전에 미세유체 장치를 준비합니다. 운동 뉴런 프로토콜에 따르면, 이것은 수요일이 될 것입니다. 10cm 페트리 접시에 70%-100% 에탄올 ~10mL를 추가합니다. 집게를 사용하여 소독을 위해 선적 컨테이너에서 페트리 접시로 장치를 옮깁니다.
2. 장치를 에탄올에 10초 동안 담그고 집게로 장치를 종이 조각에 옮겨 ~30분 동안 층류에서 자연 건조합니다. 장치를 몇 번 뒤집어 양면이 건조되도록 합니다. 장치가 건조되면 집게를 사용하여 각 장치를 개별 10cm 페트리 접시로 옮겨 쉽게 다룰 수 있습니다.
   주의: 에탄올은 독성이 있습니다. 개인 보호 장비와 함께 흄 후드를 다루십시오.
3. DPBS에서 폴리-L-오르니틴(PLO)(100μg/mL)으로 장치를 코팅하고 37°C, 5% CO₂에서 3시간 동안 배양합니다.
   1. P200 피펫을 사용하여 채널 개구부에 최대한 가까운 상단 웰의 DPBS에 100μL의 PLO를 추가하고 상단 웰에서 채널을 통해 하단 웰로 통과하는 유체를 관찰합니다. 그런 다음 DPBS의 PLO 100μL를 하단 웰에 추가합니다.
   2. 마이크로 그루브의 다른 쪽에서도 반복하고 장치의 한쪽 면에 100μL를 추가하여 장치의 미러링된 두 면 사이에 볼륨 구배를 생성하여 마이크로 그루브를 코팅합니다(예: 오른쪽 200μL, 왼쪽 300μL). 3시간 후 DPBS로 장치를 3분 동안 5회 세척합니다. 필요한 경우 흡입 시스템을 사용하십시오.
      메모: 세포를 코팅하거나 배양하는 동안 어느 지점에서든 채널에 기포가 형성되지 않도록 하십시오. 작은 기포조차도 짧은 시간에 걸쳐 팽창하여 코팅, 세포 파종 또는 채널을 가로지르는 배지 흐름을 억제합니다. 코팅 중 유체가 채널에서 멈추면 PLO 용액을 양쪽에서 채널로 직접 다시 현탁시킵니다. 기포가 여전히 존재하는 경우 200μL의 DPBS를 사용하여 채널을 플러시하고 3.3.1-3.3.2 단계에서 위에 명시된 대로 코팅 프로세스를 반복합니다. 세포 파종 후 기포가 나타나면 채널을 플러시하면 세포가 손상되므로 장치를 복구 할 수 없습니다.
4. Neurobasal 배지에 라미닌(20μg/mL)을 바르고 37°C, 5% CO₂에서 하룻밤 동안 배양합니다. PLO 코팅에 대해 3.3.1-3.3.2 단계에서 동일한 지침을 따릅니다.
5. 다음 날, P200 피펫을 사용하여 팁을 채널 개구부 반대쪽의 웰에 배치하여 웰에서 라미닌 코팅을 제거합니다. 모든 웰에 DPBS를 추가하고 세포 파종을 위해 RT에서 층류에 DPBS가 있는 장치를 그대로 둡니다.
   참고: 이 시점부터는 기포 형성을 유발할 수 있으므로 채널에서 액체(라미닌 코팅, DPBS, 매체, 고정 용액 등)를 직접 제거하지 않는 것이 중요합니다. 세포를 파종하기 전에 항상 현미경으로 장치를 검사하십시오.

4. 미세유체 장치의 NPC 도금 - 10일차

참고: 운동 뉴런 분화 프로토콜에 따르면, 10일차 NPC의 도금은 목요일에 이루어진다.

1. ROCK 억제제(10μL/mL) 용액과 함께 갓 해리된 10일차 NPC를 사용하거나 10일차 운동 뉴런 배지(표 2 및 표 3) 10mL당 저장된 NPC 1-2바이알을 해동하고 100 x g에서 4분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
2. ROCK 억제제(10 μL/mL) 용액으로 500-1000 μL의 10일차 운동 뉴런 배지에 세포 펠릿을 재현탁하고 원하는 계수 방법을 사용하여 살아있는 세포를 계수합니다.
   메모: 아래에 명시된 바와 같이, 최적의 시딩 볼륨을 수용할 수 있도록 NPC를 올바른 양의 미디어에 다시 부유해야 합니다.
3. P200 피펫을 사용하여 장치의 마이크로 홈 한쪽에 있는 두 개의 웰에서 DPBS를 제거하고 60-100μL의 10일차 운동 뉴런 배지에 장치당 250,000개의 NPC를 시드합니다.
   1. 오른쪽 상단 웰에서 채널 개구부에 가까운 30-50μL의 세포 현탁액(125,000개 세포)을 45° 각도로 파딩하고 피펫 팁을 사용하여 웰 바닥을 따라 웰 중앙을 향해 남은 유체를 부드럽게 드래그합니다.
   2. 세포 현탁액이 채널을 통해 흐를 수 있도록 몇 초 동안 일시 중지한 후 하단 웰(30-50μL의 125,000개 세포)에서 이를 반복합니다. 펜을 사용하여 파종된 면 "NPC" 또는 이에 상응하는 면을 표시하여 현미경 없이 장치의 방향을 쉽게 지정할 수 있습니다.
   3. 37 ° C, 5 % CO₂에서 5 분 동안 장치를 배양하여 세포 부착을 허용한 후 2 파종 웰에 10 일 운동 뉴런 배지 (총 200 μL / 웰)를 추가로 보충하고 37 ° C, 5 % CO₂.
      에서 다시 배양합니다. 메모: 각 웰은 200μL를 포함할 수 있습니다. 웰과 채널 모두에 세포를 파종하면 배양의 견고한 구조가 보장되어 배지 변경 중 세포 분리 위험을 낮출 수 있습니다. 채널에서만 더 적은 수의 세포를 시딩할 수 있습니다. 그러나 이것은 각 매체 변화 동안 채널을 통한 체적 전류에 배양물을 더 민감하게 만듭니다.
4. P200 피펫을 사용하여 갓 파종된 NPC 맞은편에 있는 마이크로홈의 반대편에 있는 두 웰에서 DPBS를 제거합니다.200μL/웰의 10일차 운동 뉴런 배지를 추가하고 배지가 채널을 통해 흐를 수 있도록 상단과 하단 웰 사이에서 몇 초간 기다립니다. 그런 다음 배양 중 배지의 증발을 방지하기 위해 장치 주위에 6cm 접시당 10mL의 DPBS를 추가합니다.
   메모: 필요한 경우 배양 기간 동안 장치 주변에 DPBS를 추가합니다.
5. 11일(금요일), 14일(월요일) 및 16일(수요일)에 장치의 두 구획에서 전체 운동 뉴런 매체 변화를 수행합니다(표 2 및 표 3). 매체 변경 당일에 신선한 미디어 보충제를 추가하십시오.
   메모: 이 시점부터 P200 파이펫으로 모든 매체 변경을 수행합니다. 항상 피펫 팁을 웰 가장자리의 채널에서 멀리 배치하고 채널에서 직접 액체를 제거하지 마십시오. 실리콘 장치를 분리하지 않도록 주의하십시오. 배지 제거 및 추가는 세포 분리를 방지하기 위해 천천히 수행해야 합니다.
   1. P200 피펫 팁을 채널 개구부 맞은편에 있는 웰 벽의 하단 가장자리에 배치하여 NPC가 있는 두 웰의 모든 매체를 조심스럽게 제거합니다. P200 피펫 팁을 채널 개구부 맞은편 웰 벽의 상단 가장자리에 배치하여 50-100μL의 새로운 운동 뉴런 배지를 상단 웰에 천천히 추가합니다.
   2. 50-100 μL의 운동 뉴런 배지를 하단 웰에 추가하기 전에 배지가 채널을 통해 흐를 수 있도록 몇 초 동안 일시 중지하십시오. 두 웰에 200μL/well이 포함될 때까지 이 과정을 조심스럽게 반복합니다. 세포가 없는 쪽도 반복합니다.

5. 미세유체 장치의 MAB 도금 - 17일차

1. 미세유체 장치에서 MAB를 파종하기 약 7일 전(운동 뉴런 분화 10일차)에 MAB를 해동하고 콜라겐으로 코팅된 T75 플라스크의 성장 배지(표 1)에서 파종하여 충분한 세포 증식을 허용합니다. 섹션 2를 참조하십시오.
2. 운동 뉴런 분화 17일째(목요일)에 2.4단계에서 설명한 대로 MAB를 해리하고, 세포 펠릿을 ~500μL의 성장 배지에 재현탁하고, 선호하는 계수 방법을 사용하여 살아있는 세포를 계수합니다.
   메모: 아래에 명시된 바와 같이, 최적의 시딩 부피를 수용할 수 있도록 MAB를 올바른 양의 배지에 재현탁
해야 합니다.
3. P200 피펫을 사용하여 장치의 마이크로홈의 시딩되지 않은 쪽에 있는 운동 뉴런 배지를 제거하고, DPBS로 부드럽게 세척한 다음 60-100μL의 성장 배지에 장치당 200,000MAB를 시딩합니다.
   1. 오른쪽 상단 웰에서 30-50μL의 세포 현탁액(100,000개 세포)을 채널 개구부 가까이에 45° 각도로 파딩하고 나머지 유체를 웰 바닥을 따라 피펫 팁을 사용하여 웰 중앙으로 부드럽게 드래그합니다. 하단 웰(30-50 μL에 100,000 세포)에서 반복하기 전에 채널을 통한 세포의 흐름을 허용하기 위해 몇 초 동안 일시 중지합니다.
   2. 장치를 37°C, 5% CO₂에서 5분 동안 배양하여 세포 부착을 허용한 후 새로 MAB를 파종한 두 개의 웰에 추가 성장 배지(총 200μL/웰)를 보충합니다. 37 °C, 5 % CO 2에서 다시 배양하십시오₂.
      알림: 17일째에는 장치의 운동 뉴런 쪽에서 중간 변화가 필요하지 않습니다. 17일차: 이전에 발표된 운동 뉴런 분화 방법에 따른 매체 변화는 대신 18일차(금요일)에 수행됩니다.

6. MAB 구획을 향한 운동 뉴런 신경돌기의 성장을 촉진하기 위한 체적 및 화학주성 구배의 구현

1. 18일째에 18일째 운동 뉴런 매체(200μL/well)로 운동 뉴런 쪽에서 완전한 매체 변화를 수행합니다. 4.5.1-4.5.2단계에서 언급한 중간 변경 사항에 대한 지침을 따릅니다. 장치의 MAB 구획에서 MAB 차별화를 시작합니다(표 2 및 표 4).
   1. 0.01 μg/mL의 human agrin(200 μL/well)이 보충된 예열된 MAB 분화 배지(표 4)를 추가하기 전에 DPBS로 MAB 구획을 한 번 조심스럽게 세척합니다.
      메모: MAB는 일주일 동안 융합하여 다핵 근관을 형성합니다.
2. 21일째에 운동 뉴런 분화 프로토콜(월요일)에 따라 화학주성 및 체적 구배를 시작합니다(표 2 및 표 3).
   1. 30ng/mL의 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 신경교세포주 유래 신경 영양 인자(GDNF) 및 섬모 신경 영양 인자(CNTF), 인간 아그린(0.01 μg/mL) 및 라미닌(20 μg/mL)이 있는 200 μL/웰의 운동 뉴런 기저 배지를 근관 구획(이전에 MAB 구획으로 정의됨)에 추가합니다. 성장 인자가없는 운동 뉴런 기저 매체 (100 μL / well)를 운동 뉴런 구획에 추가합니다.

표 1: MAB 성장 배지.배지는 4 ° C에서 2 주 동안 지속될 수 있습니다. bFGF는 사용 당일에 신선하게 추가됩니다.

)

시약	재고 집중도	최종 집중
국제경영시스템(IMDM	1배	80%
소 태아 세럼		15%
페니실린/스트렙토마이신	5000 U/mL	0.5%
L-글루타민	50배	1%
나트륨 피루브산	100 밀리미터미터	1%
비필수 아미노산	100배	1%
인슐린: 트랜스페린, 셀레늄	100배	1%
bFGF (신선 추가)	50 μg/mL	5 ng / mL

표 2: 운동 뉴런 기저 매질.배지는 4 ° C에서 4 주 동안 지속될 수 있습니다.

시약	재고 집중도	최종 집중
DMEM/F12		50%
Neurobasal 배지		50%
페니실린/스트렙토마이신	5000 U/mL	1%
L-글루타민	50배	0.5 %
N-2 보충제	100배	1%
비타민 A가 없는 B-27	50배	2%
β-메르캅토에탄올	50 밀리미터.	0.1%
아스코르브산	200 마이크로미터	0.5 μM의

표 3: 운동 뉴런 매체 보충제.보충제는 사용 당일에 운동 뉴런 기저 배지에 신선하게 첨가됩니다.

표시기 표시기 표시기 표시기 표시기 표시기 표시기 표시기

하루	시약	재고 집중도	최종 집중	컴파트먼트
일차 10/11	부드러운 작용제	10 밀리미터미터	500nM	둘다
	레티노산	1 밀리엠	0.1 μM
	대시	100 밀리미터미터	10 μM
	증권 시세	0.1 mg/mL	10 ng / mL
	지그엔프	0.1 mg/mL	10 ng / mL
14일차	대시	100 밀리미터미터	20 μM	둘다
	증권 시세	0.1 mg/mL	10 ng / mL
	지그엔프	0.1 mg/mL	10 ng / mL
16일차	대시	100 밀리미터미터	20 μM	둘다
	증권 시세	0.1 mg/mL	10 ng / mL
	지그엔프	0.1 mg/mL	10 ng / mL
	증권 시세	0.1 mg/mL	10 ng / mL
18일차	증권 시세	0.1 mg/mL	10 ng / mL	운동 뉴런
	지그엔프	0.1 mg/mL	10 ng / mL
	증권 시세	0.1 mg/mL	10 ng / mL
21일차+	증권 시세	0.1 mg/mL	30 ng / mL	묘튜브
	지그엔프	0.1 mg/mL	30 ng / mL
	증권 시세	0.1 mg/mL	30 ng / mL
	아그린	50 μg/mL	0,01 μg/mL
	라미닌	1 밀리그램 / mL	20 μg/mL
21일째+	보충제 없음			운동 뉴런

표 4: MAB 분화 매체.배지는 4 ° C에서 2 주 동안 지속될 수 있습니다. Agrin은 사용 당일에 신선하게 추가됩니다.

하루	시약	재고 집중도	최종 집중	컴파트먼트
18일차	DMEM/F12		97%	MAB
	나트륨 피루브산	100 밀리미터미터	1%
	호스 세럼		2%
	아그린	50 μg/mL	0.01 μg/mL

결과

그림 1: 미세유체 장치의 모터 유닛 프로토콜에 대한 개략도.운동 뉴런 분화 프로토콜의 타임라인에 따른 0일차부터 28일차까지의 분화 타임라인 및 공동 배양 개요. iPSC와 운동 뉴런 분화는 0일째에 시작되어 다음 10일 동안 앞서 언급한 대로 수행됩니다. 9일째에는 장치를 멸균하고 PLO-laminin으로 코팅합니다. MAB는 T75 플라스크에서 팽창을 위해 해동됩니다. 10일째에 운동 뉴런-NPC는 두 웰과 장치의 한 구획(밝은 회색)의 채널에 도금되어 운동 뉴런으로의 분화가 일주일 동안 계속됩니다. MAB는 17일째에 양쪽 웰과 반대쪽 격실(짙은 회색)의 채널에 도금됩니다. 18일째에 MAB의 근관으로의 분화가 시작됩니다. 21일째에는 장치의 마이크로홈을 통해 운동 뉴런-신경돌기 분극을 촉진하기 위해 체적 및 화...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세트산	켐-랩 NV	CL00.0116.1000	코팅 구성 요소. H226, H314입니다. P280
Agrin(재조합 인간 단백질)	R&D 시스템	6624-AG-050	미디어 보충 자료
아스코르브산	시그마	A4403	미디어 구성 요소
βIII-튜불린(튜불린)	아브캠	AB7751	항체 (1:500)
β-메르캅토에탄올	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31350010	미디어 구성 요소. H317입니다. P280.
비타민 A가 없는 B-27	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제12587-010	미디어 구성 요소
BDNF(뇌 유래 신경 영양 인자)	페프로텍	450-02B	성장 요인
bFGF (재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자)	페프로텍	100-18B	성장 요인
송아지 가죽에서 추출한 콜라겐	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	17104019	코팅 성분
CNTF(섬모 신경 영양 인자)	페프로텍	450-13ᄂ	성장 요인
대시	토크리스 바이오사이언스	2634	미디어 보충 자료
DMEM/F12	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11330032	미디어 구성 요소
디엠소	시그마	D2650-100ML	동결 보존 구성 요소. H315, H319, H335입니다. P280.
둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	14190250	칼슘 없음, 마그네슘 없음
에탄올	폭스바겐	20.821.296	멸균. H225입니다. P280
소 태아 세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	10270106	미디어 구성 요소
형광 장착 매체	다코	시즌 3023	면역세포화학 성분
GDNF (신경교세포주 유래 신경영양인자)	페프로텍	450-10B	성장 요인
호스 세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	16050122	미디어 구성 요소
국제경영시스템(IMDM	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	12440053	미디어 구성 요소
인슐린: 트랜스페린, 셀레늄	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	41400045	미디어 구성 요소
Knockout 세럼 교체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제10828-028	Cryopreservation 구성 요소
Engelbreth-Holm-Swarm 쥐 육종 기저막의 라미닌	시그마	L2020-1MG	코팅 구성 요소 및 매체 보충
L-글루타민	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제25030-024	미디어 구성 요소
N-2 보충제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제17502-048	미디어 구성 요소
Neurobasal 배지	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	21103049	코팅 및 매체 구성 요소
비필수 아미노산	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11140050	미디어 구성 요소
파라필름 M	시그마	P7793-1개	장비 보관
페니실린/스트렙토마이신(5000 U/mL)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15070063	미디어 구성 요소
페트리 접시 (3cm)	수녀	153066	지름 : 3cm
페트리 접시 (10cm)	사르슈테트	833.902	지름: 10 cm
플레이트(6웰)	Cellstar Greiner 바이오 원	657160	문화 플레이트
폴리-L-오르니틴(PLO)	시그마	P3655-100MG	코팅 성분
레티노산	시그마	R2625	미디어 보충 자료. H302, H315, H360FD, H410. P280.
Revita 세포 보충제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A2644501	ROCK 억제제 용액
부드러운 작용제	상품 Millipore	566660	미디어 보충 자료
나트륨 피루브산	생명 기술	제11360-070	미디어 구성 요소
T75 플라스크	시그마	CLS3276	문화 플레이트
TrypLE 익스프레스	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	12605010	MAB 해리 솔루션
투보시라린 염산염 펜타하이드레이트	시그마	T2379-100지	아세틸콜린 수용체 차단제. H301입니다. P280.
XonaChips 사전 조립된 미세유체 장치	Xona 미세유체역학	XC150	마이크로 그루브 길이 : 150 μm

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