미세유체 소자(microfluidic device)를 이용한 신경근접합부 생성

Abstract

출처: Stoklund Dittlau, K. et al., 미세유체 장치에서 기능적 신경근 접합부가 있는 인간 운동 단위 생성.J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 미세유체 장치를 사용하여 신경근 접합부의 형성을 보여줍니다. 신경 전구 세포와 근육 전구 세포는 장치 내의 다른 웰에 파종되고 각각 운동 뉴런과 근관으로 성숙하도록 방치됩니다. 부피와 화학적 구배의 생성은 활성 신경근 접합부의 발달로 이어집니다.

Protocol

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

이 프로토콜에 사용되는 모든 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있으며 멸균 상태로 사용해야 합니다. 미디어는 달리 명시되지 않는 한 사용하기 전에 실온(RT)으로 가열해야 합니다. 공동 배양 프로토콜에 대한 개요는 그림 1을 참조하십시오.

1. 유도만능줄기세포(iPSC)와 운동 뉴런 전구세포의 분화

1. 이전 연구에서 채택된 운동 뉴런 분화 프로토콜을 따라 10일차 신경전구세포(NPC) 상태에 도달할 때까지 따릅니다. 프로토콜의 기간에 따라 차별화는 월요일(0일차)에 시작되며, 그 결과 목요일에 10일차 NPC가 발생합니다.
2. 10일차 NPC를 바이알당 2 x 10⁶- 4 x 10⁶ 세포의 밀도에서 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 녹아웃 혈청 교체에 동결 보존합니다.
   주의: DMSO는 독성이 있습니다: 개인 보호 장비와 함께 흄 후드를 취급하십시오.
   참고: 하루 1....

Results

그림 1: 미세유체 장치의 모터 유닛 프로토콜에 대한 개략도.운동 뉴런 분화 프로토콜의 타임라인에 따른 0일차부터 28일차까지의 분화 타임라인 및 공동 배양 개요. iPSC와 운동 뉴런 분화는 0일째에 시작되어 다음 10일 동안 앞서 언급한 대로 수행됩니다. 9일째에는 장치를 멸균하고 PLO-laminin으로 코팅합니다. MAB는 T75 플라스크에서 팽창을 위해 해동됩니다. 10일째에 운동 뉴런-NPC는 두 웰과 장치의 한 구획(밝은 회색)의 채널에 도금되어 운동 뉴런으로의 분화가 일주일 동안 계속됩니다. MAB는 17일째에 양쪽 웰과 반대쪽 격실(짙은 회색)의 채널에 도금됩니다. 18일째에 MAB의 근관으로의 분화가 시작됩니다. 21일째에는 장치의 마이크로홈을 통해 운동 뉴런-신경돌기 분극을 촉진하기 위해 체적 및 화.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아세트산	켐-랩 NV	CL00.0116.1000	코팅 구성 요소. H226, H314입니다. P280
Agrin(재조합 인간 단백질)	R&D 시스템	6624-AG-050	미디어 보충 자료
아스코르브산	시그마	A4403	미디어 구성 요소
βIII-튜불린(튜불린)	아브캠	AB7751	항체 (1:500)
β-메르캅토에탄올	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31350010	미디어 구성 요소. H317입니다. P280.
비타민 A가 없는 B-27	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제12587-010	미디어 구성 요소
BDNF(뇌 유래 신경 영양 인자)	페프로텍	450-02B	성장 요인
bFGF (재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자)	페프로텍	100-18B	성장 요인
송아지 가죽에서 추출한 콜라겐	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	17104019	코팅 성분
CNTF(섬모 신경 영양 인자)	페프로텍	450-13ᄂ	성장 요인
대시	토크리스 바이오사이언스	2634	미디어 보충 자료
DMEM/F12	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11330032	미디어 구성 요소
디엠소	시그마	D2650-100ML	동결 보존 구성 요소. H315, H319, H335입니다. P280.
둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	14190250	칼슘 없음, 마그네슘 없음
에탄올	폭스바겐	20.821.296	멸균. H225입니다. P280
소 태아 세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	10270106	미디어 구성 요소
형광 장착 매체	다코	시즌 3023	면역세포화학 성분
GDNF (신경교세포주 유래 신경영양인자)	페프로텍	450-10B	성장 요인
호스 세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	16050122	미디어 구성 요소
국제경영시스템(IMDM	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	12440053	미디어 구성 요소
인슐린: 트랜스페린, 셀레늄	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	41400045	미디어 구성 요소
Knockout 세럼 교체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제10828-028	Cryopreservation 구성 요소
Engelbreth-Holm-Swarm 쥐 육종 기저막의 라미닌	시그마	L2020-1MG	코팅 구성 요소 및 매체 보충
L-글루타민	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제25030-024	미디어 구성 요소
N-2 보충제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제17502-048	미디어 구성 요소
Neurobasal 배지	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	21103049	코팅 및 매체 구성 요소
비필수 아미노산	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11140050	미디어 구성 요소
파라필름 M	시그마	P7793-1개	장비 보관
페니실린/스트렙토마이신(5000 U/mL)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15070063	미디어 구성 요소
페트리 접시 (3cm)	수녀	153066	지름 : 3cm
페트리 접시 (10cm)	사르슈테트	833.902	지름: 10 cm
플레이트(6웰)	Cellstar Greiner 바이오 원	657160	문화 플레이트
폴리-L-오르니틴(PLO)	시그마	P3655-100MG	코팅 성분
레티노산	시그마	R2625	미디어 보충 자료. H302, H315, H360FD, H410. P280.
Revita 세포 보충제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A2644501	ROCK 억제제 용액
부드러운 작용제	상품 Millipore	566660	미디어 보충 자료
나트륨 피루브산	생명 기술	제11360-070	미디어 구성 요소
T75 플라스크	시그마	CLS3276	문화 플레이트
TrypLE 익스프레스	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	12605010	MAB 해리 솔루션
투보시라린 염산염 펜타하이드레이트	시그마	T2379-100지	아세틸콜린 수용체 차단제. H301입니다. P280.
XonaChips 사전 조립된 미세유체 장치	Xona 미세유체역학	XC150	마이크로 그루브 길이 : 150 μm