micro-electrode arrays에 결합된 3차원 뉴런 네트워크 구축

초록

출처: Tedesco, M., et al., 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 해마 뉴런이 있는 평면 미세 전극 어레이에 결합된 3D 뉴런 배양의 발달을 보여줍니다. 분리된 뉴런은 미세 전극 어레이의 활성 영역에서 2D 네트워크를 형성하고 멤브레인 인서트가 있는 다중 웰 플레이트의 유리 마이크로비드에 부착됩니다. 이러한 뉴런 코팅된 마이크로비즈를 전극으로 전달하면 상호 연결된 3D 신경망으로 구성됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 배아의 해부와 조직의 해리

1. 성인 암컷 쥐 (200-250g)를 일정한 온도 (22 ± 1 ° C)와 상대 습도 (50 %)에서 규칙적인 명암 일정 (오전 7 시부 터 오후 7 시까 지)에 따라 수용합니다. 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 합니다.
2. 18% 이소플루란을 사용하여 18일(E18) 임신한 암컷 쥐를 마취합니다. 그런 다음 경추 탈구로 동물을 희생하십시오.
3. 각 쥐 배아에서 해마를 제거하고 Ca²⁺ 및 Mg²⁺가 없는 얼음처럼 차가운 Hank의 균형 잡힌 소금 용액에 넣습니다. 발달 18일째에는 해마와 피질 조직이 매우 부드러워서 작은 조각으로 자를 필요가 없습니다. 자세한 내용은 확인할 수 있습니다.
4. 0.05%의 DNAse를 함유한 Trypsin/Hank's 용액의 0.125%에서 37°C에서 18-20분 동안 조직을 해리합니다.
5. 파스퇴르 피펫으로 상층액을 제거하고 10% 소태아혈청(FBS)이 함유된 배지를 5분 동안 첨가하여 효소 분해를 중지합니다.
6. FBS로 배지를 제거하고 보충제, 1% L-글루타민, 겐타마이신 10μg/ml가 포함된 배지로 한 번 세척합니다. 파스퇴르 피펫으로 배지를 다시 제거하고 보충제, 500% L-글루타민, 겐타마이신 10μg/ml와 함께 소량(μl)의 성장 배지로 다시 채웁니다.
7. 세포의 유백색 현탁액이 분명해질 때까지 좁은 파스퇴르 피펫으로 조직 펠릿을 기계적으로 해리합니다. 세포 현탁액을 원심분리할 필요는 없습니다.
8. 소량의 세포 현탁액을 성장 배지로 희석하여 2.0ml의 최종 부피를 얻습니다.혈구계 챔버로 얻어진 세포 농도를 계산합니다. 600-700 cells/μl의 원하는 세포 농도를 얻기 위해 이 농도를 1:5로 희석합니다.

2. 셀 도금

1. PDMS 제약 조건에 의해 정의된 MEA의 활성 영역에 약 2,000 cells/mm²의 밀도로 2D 뉴런 네트워크를 생성하는 플레이트 셀.
   메모: 각 해마는 약 5 x 10⁵ 개의 세포 (단일 배아의 경우 1 x 10⁶)를 포함합니다. 6개의 배아를 해부하여 2ml에 6 x 10⁶개의 세포를 총 양과 3,000 cells/μl의 농도로 추정합니다. 원하는 세포 농도를 얻기 위해 이 농도를 1:5로 희석하고 약 600-700 cells/μl를 플레이트화합니다. PDMS 제약 조건에 의해 구분 된 MEA 영역이 약 7.065 mm²이고 도금 된 셀의 총 수가 600 cells / μl x 24 μl = 14,400 cell인 경우 최종 밀도는 2,038 cells / mm²입니다.
2. MEA 장치를 2°C에서 가습된 CO₅기압(37%)으로 인큐베이터에 넣습니다.
3. 600-700 cells/μl(약 100,000 cells)의 세포 농도를 가진 160 μl의 현탁액을 멀티웰 플레이트 내부에 위치한 마이크로비드 단층의 표면에 분배하여 3차원 배양 구축을 위한 예비 단계를 완료합니다. 멀티웰 플레이트를 37°C에서 가습된 CO₂ 기압(5%)으로 인큐베이터에 넣습니다.

3. 3D 신경 네트워크 구축

1. 도금 후 6-8시간 후, 약 30-40μl의 부피에 대해 설정된 피펫을 사용하여 PDMS 제약에 의해 구분된 영역 내부로 멀티웰 플레이트의 현탁액(뉴런이 있는 마이크로비드)을 매우 조심스럽게 옮깁니다. 각 이송 후 마이크로비즈가 육각형의 컴팩트한 구조로 자체 조립될 수 있도록 약 30분 동안 기다립니다.
2. 모든 레이어가 증착되고 자발적으로 조립되면 PDMS 제약 조건으로 구분된 영역의 맨 위에 약 300μl의 매체를 크게 떨어뜨려 다시 채웁니다.
3. MEA에 결합된 3D 구조를 인큐베이터(T = 37.0 °C, CO₂ = 5%)에 48시간 동안 넣은 후 보충제와 함께 최종 부피(약 1ml)의 성장 배지 배양을 추가합니다.
   메모: 멤브레인 인서트가 있는 멀티웰 플레이트의 총 비드 수(30,000개)와 MEA 장치의 단일 레이어에 있는 비드 수(6,000개)를 고려하십시오. 생성된 3D 구조는 5개의 마이크로비드 및 세포 층으로 구성됩니다. 3D 뉴런 네트워크가 기하학적으로 완벽하지 않다는 점을 고려할 때, 결과 3D 구조는 5-8개의 레이어로 구성될 수 있습니다.
4. 도금 다음 날, MEA 링 내부에 배지의 최종 부피(약 900μl)를 조심스럽게 추가합니다. 37°C의 가습된 CO₂ 대기(5%)에서 4-5주 동안 3D 배양을 유지합니다. 일주일에 한 번 배지의 절반을 교체하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
라미닌	시그마-알드리치	엘2020	0.05 μg/ml
폴리-D-라이신	시그마-알드리치	P6407	0.05 μg/ml
트립신	지브코	제25050-014	0.125% 희석된 1:2 HBSS에서 칼슘 및 마그네슘 이온 없음
디엔아제	시그마-알드리치	D5025	행크스 용액에 0.05% 희석
뉴로기저	Gibco Invitrogen	21103049	문화 매체
나27	Gibco Invitrogen	17504044	2% 중간 공급
소 태아 혈청(FBS)	시그마-알드리치	F-2442	10%
글루타맥스-I	지브코	35050038	0.5 밀리미터.
겐타마이신	시그마-알드리치	G.1272	5mg/리터
폴리-디메틸-실록산(PDMS)	코닝 시그마	481939	경화제 및 고분자
마이크로 전극 어레이	다중 채널 시스템(MCS)	60MEA200/30-티타늄-홍보	MEA 포함: 전극 그리드 8x8; 전극 간격 및 직경은 각각 200 및 30 μm입니다. 실이 없는 플라스틱 링
마이크로비드	Distrilab-듀크 사이언티픽	9040	1gr 유리 Part.Size 표준 40 μm
트랜스웰	코스타 시그마	CLS 3413 (영어	멤브레인 인서트가 있는 멀티웰 플레이트(직경 6.5mm, 다공성 0.4μm)
HBSS 칼슘 및 마그네슘 이온 없음	Gibco Invitrogen	제14175-052
행크스 버퍼 솔루션	시그마	H8264
쥐	스프라그 돌리	위스타 쥐