동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 피질 성상세포의 준비 및 배양
참고: 뉴런이 준비되기 전에 성상교세포 배양이 합류 단층으로 발달해야 하므로 다음 단계로 진행하기 전에 프로토콜의 이 단계를 최소 7일 전에 완료하십시오. 1차 성상세포는 출생 후일(P) 0-3경에 새끼 쥐에서 얻은 혼합 신경교세포에서 파생됩니다. T75 플라스크당 3개의 뇌(6개의 피질)가 사용된다.
- 무균 조건에서 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)에 10% v/v 말 혈청과 0.1% v/v 겐타마이신을 보충하여 성상세포 배지를 준비합니다. 배지를 4°C에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
- 6% v/vCO2가 있는 상태에서 37°C에서 최소 1시간 동안 10μg/mL 폴리-D-라이신(PDL, 세포 배양 등급 물)으로 3x T75 플라스크를 코팅합니다. 코팅 후 플라스크를 인산염 완충 식염수(PBS)로 두 번 세척하여 결합되지 않은 양이온을 제거하고 9mL 성상세포 배지를 추가합니다.
- 뇌 준비를 위해 1x 10cm 페트리 접시에 10mL Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)을 추가하고 1x 15mL 튜브에 1mL HBSS(사용할 뇌 수에 관계없음)를 추가합니다. 수술용 가위, 가는 집게 2개, 쌍안경을 시술을 위해 손이 닿는 곳에 두십시오.
- 수술용 가위로 새끼 3마리의 목을 빠르게 베고 머리를 10cm 크기의 빈 접시에 모읍니다.
- 쌍안경 아래에서 피질 준비를 수행하십시오. 두 개의 가는 집게를 사용하여 목에서 시작하여 눈높이까지 정중선의 두개골에서 등쪽 피부를 제거합니다. 그 후, 혈관이 있는 뇌가 두개골 아래에서 볼 수 있습니다.
- 한 쌍의 집게로 머리를 머리 끝에서 고정하고 뒤쪽 끝에서 시작하여 두개골의 정중선을 절개합니다. 그런 다음 두개골의 오른쪽과 왼쪽 절반을 잘라내어 뇌를 노출시킵니다.
- 겸자의 끝을 닫고 뇌 아래 복부에 위치시킵니다. 두개골에서 뇌를 들어 올려 HBSS가 채워진 10cm 페트리 접시에 넣습니다. 모든 뇌가 접시에 모일 때까지 나머지 표본에 대해서도 같은 방식으로 진행한다.
- 뇌를 채취한 후, 가위와 같은 집게를 사용하여 뒷뇌를 꼬집어 피질을 분리하는 것부터 시작한다. 한 쌍의 집게로 두 반구 사이의 정중선 절개를 수행합니다. 집게로 뇌를 조심스럽게 고정하고 두 번째 집게를 사용하여 중뇌와 후각구를 잘라 피질 반쪽으로 끝냅니다.
- 한 쌍의 집게로 한쪽 피질 반쪽을 고정하고 측면 가장자리에서 수막을 분리한 다음 두 번째 집게를 사용하여 피질 표면에서 당겨 반구에서 수막을 벗겨냅니다.
- 표면이 접시를 향해 아래를 향하도록 피질 반쪽을 뒤집습니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 초승달 모양의 해마를 조심스럽게 해부하고 제거합니다. 개별 피질을 운반하기 위해 하나의 닫힌 집게를 사용하여 단일 피질을 원뿔형 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 모든 피질을 수집한 후 무균 층류 후드로 이동하여 피질 조직의 해리를 위한 준비부터 시작합니다.
- 2mL 반응 튜브에 1mL DMEM을 넣고 0.1% w/v 파파인(30단위)을 추가합니다. 정화된 용액이 개발될 때까지(약 3분) 37°C의 수조에서 현탁액을 배양합니다. 0.24 mg/mL L-시스테인과 20 μg/mL DNAse를 넣고 부드럽게 흔듭니다.
참고: 소화를 위해서는 약 1mL의 효소 용액이 필요합니다.
- 필터(0.22μm 공극 크기)를 사용하여 피질 조직에 추가하기 전에 1mL의 멸균 용액을 얻습니다. 37 °C에서 30 분 - 1 시간 동안 튜브를 배양합니다 (즉, 수조에서).
참고: 1.11 - 1.14단계는 매우 중요하며 15분 이내에 완료해야 합니다.
- 분해 반응을 종결하려면 1mL 성상세포 배지를 추가하고 1mL 피펫을 사용하여 절단된 조직을 조심스럽게 분쇄합니다. 분쇄를 위해 피펫 플런저를 부드럽게 움직여 피질 조직 현탁액을 흡인 및 압출합니다.
- 조직이 단일 세포 현탁액으로 해리되면 5mL 성상세포 배지를 추가하고 216 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 생성된 펠릿에서 상등액을 조심스럽게 흡인하고 1mL 성상세포 배지에서 세포를 재현탁합니다.
- 9mL 성상교세포 배지가 보충된 T75 플라스크에 세포 현탁액을 추가합니다(1.2 참조).
- 6% v/v CO2가 존재하는 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양합니다. 4일 후 첫 번째 완전한 매체 변경(10mL)을 수행합니다. 그 후, 2-3일마다 배양 배지를 교체하십시오.
- 7일 후 세포가 confluent monolayer를 형성했는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 문화의 완전한 합류가 이루어질 때까지 2-3일 더 기다리십시오.
참고: 성상세포는 크고 편평한 세포체를 나타내고, 플라스크 바닥에 국한되며, 눈에 띄는 세포 돌기를 발달시키지 않습니다. 그들은 단층 위에 존재하는 작은 위상 대비의 밝은 전구 세포 및 미세아교세포와 다릅니다.
- 전구 세포를 제거하고 순수한 성상세포 배양을 얻기 위해 T75 플라스크를 오비탈 쉐이커에 놓고 배양액 O/N을 250rpm으로 흔듭니다. 온도가 37°C로 조정되고 플라스크의 필터가 CO 2의 증발을 방지하기 위해 실험실 필름으로 밀봉되어 있는지 확인하십시오.
- 다음날, 배지를 흡인하고 20μM 시토신-1-β-D-아라비노푸라노시드(AraC)가 보충된 10mL의 신선한 배양 배지를 추가하여 잔류 분열 세포를 제거합니다.
참고 : 37 ° C의 인큐베이터에서 2 - 3 d 동안 AraC로 배양하면 6 % CO2가 순수한 성상 세포 배양으로 이어집니다.
- 광학 현미경으로 육안 검사를 통해 성상세포 배양의 순도를 모니터링합니다. 잔류 위상차 밝은 전구 세포와 미세아교세포가 여전히 성상세포 단층 위에 존재하는 경우(1.16단계 참조) 1.18 및 1.19.
단계를 반복합니다.
참고: 융합 및 순수 성상교세포 단층은 다음 단계로 진행하기 전에 인큐베이터에서 최대 14d(37°C, 6% v/v CO2) 동안 유지할 수 있습니다. 3d마다 매체의 절반을 변경합니다. 성상세포를 수집, 동결 및 해동하지 마십시오.이 세포는 저장 절차를 통해 신경 세포지지 특성을 잃게 됩니다.
2. 간접 공동 배양을 위한 성상세포 준비
참고: 뉴런을 준비하기 48 - 72시간 전에 성상세포를 세포 배양 삽입물로 이동합니다. 일반적으로 단일 T75 플라스크는 하나의 제제로 얻은 신경 세포 배양을 지원하기에 충분한 수의 세포를 제공합니다.
- 24웰 플레이트에 필요한 만큼의 인서트를 배치합니다. 각 삽입물을 10μg/mL PDL(세포 배양 등급 물에 용해)로 37°C, 6% v/v CO2에서 약 1시간 동안 코팅합니다. 배양 후 PBS로 삽입물을 두 번 세척하십시오. 그 동안 성상교세포의 준비를 진행하십시오.
참고: PBS로 채워진 삽입물은 성상교세포 현탁액을 사용할 준비가 될 때까지 보관할 수 있습니다.
- 성상세포 배지(AraC 포함)를 흡인하고 10mL PBS로 배양액을 한 번 세척하여 잔류 혈청이 제거되었는지 확인합니다.
- 플라스크에 0.05% 트립신-EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 3mL를 추가하고 약 10분 동안 37°C, 6% v/v CO2에서 트립신화를 위해 세포를 배양합니다.
- 현미경을 사용하여 육안 검사로 세포 분리를 제어하고 플라스크 측면을 데스크탑에 두드려 세포의 분리를 용이하게 합니다.
참고: 2.5 - 2.8단계는 매우 중요하며 15 - 20분 이내에 완료해야 합니다.
- 트립신화 후 7mL 성상세포 배지에 세포를 부드럽게 재현탁시키고 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다. 216 x g에서 5분간 원심분리기
.
- 상등액을 조심스럽게 흡인하고 세포 펠릿을 1mL 성상세포 배지에 재현탁합니다.
- 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.
- 24웰 플레이트의 웰 바닥을 500μL 성상세포 배지로 채우고 500μL 성상세포 배지에 있는 25,000개의 세포를 각 개별 삽입체로 옮깁니다. 37 °C, 6 % v / v CO 2에서 배양하십시오2.
참고: 42 - 72 시간 후에 배양액은 약 100% 합류점에 도달합니다. 이 단계에서 배양액의 순도는 면역세포화학으로 확인할 수 있습니다. confluent culture는 다음 단계로 진행할 때까지 최대 7d 동안 유지될 수 있습니다. 3일마다 매체의 절반을 교체하십시오.
3. 1차 해마 뉴런의 준비
참고: 1차 마우스 해마 뉴런은 시간이 지정된 임신 마우스의 E15.5 - E16 배아에서 파생되어야 합니다.
- 뉴런 배지(10mM 피루브산 나트륨, 0.1% w/v 오브알부민, 2% v/v B27 배지 보충제 및 0.1% v/v 겐타마이신(멸균 여과))가 포함된 MEM) 및 준비 배지(0.6% w/v 포도당 및 10mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산)을 함유한 HBSS)를 준비합니다. 37 ° C, 6 % v / v CO2에서 필터 플라스크의 뉴런 매체를 사전 예열 및 사전 평형화합니다.
- 유리 커버 슬립 (직경 12mm)을 24 웰 플레이트의 웰에 놓습니다 (세포 배양 인서트와 함께 사용하기 위해 노치가있는 특수 커버 슬립 사용).
- 37°C에서 15μg/mL 폴리-DL-오르니틴을 물(세포 배양 등급)에 1μg/mL 이상 코팅합니다. 웰당 최소 500μL를 사용하여 커버슬립이 완전히 덮이도록 합니다. PBS로 우물을 두 번 씻으십시오. 세포를 도금할 때까지 PBS를 웰에 그대로 두십시오. 우물이 마르지 않는지 확인하십시오.
- 해마를 해부하려면 배지로 채워진 10cm 접시 3개와 1mL 배지가 있는 2mL 튜브 1개를 준비합니다. 가위와 가는 집게 2개를 준비합니다.
- 임신한 쥐는 자궁경부 탈구로 제물로 바치고, 70% v/v 에탄올로 세척하여 복부를 살균하고, 날카로운 가위로 복부를 엽니다. 구슬로 맺힌 자궁을 가위로 조심스럽게 절제하고 장기를 준비 매체로 채워진 1x 10cm 접시에 옮깁니다.
- 다음으로 자궁에서 배아를 제거합니다. 조심스럽게 자궁을 절개하고 집게 2개를 사용하여 배아에 해를 끼치지 않고 양막을 제거합니다. 그런 다음 가위로 각 배아의 목을 자르고 머리를 준비 배지와 함께 제공된 두 번째 10cm 접시에 옮깁니다.
- 머리 준비를 진행하십시오 (1.4-1.7에 설명 된 준비와 유사).
- 한 쌍의 집게로 머리를 고정하고 신경축에 수직인 뒷뇌에 가까운 목 부위의 두개골과 피부를 절개합니다. 두 번째 집게를 사용하여 두개골과 덮고 있는 피부를 모두 들어 올리고 부드러운 두개골 캡을 머리의 끝 쪽으로 구부려 뇌를 노출시킵니다.
- 2개의 집게를 사용하여 두개강에서 뇌를 분리하십시오. 이렇게 하려면 집게 1쌍을 닫고 후각구에서 시작하여 후뇌로 이동하여 두개골에서 뇌를 분리합니다. 준비 매체로 채워진 다른 10cm 접시에 뇌를 모으십시오.
- 성상세포 준비를 위해 위에서 설명한 대로 피질 부분에서 해마를 해부합니다(단계 1.6). 각 반구에서 해마를 제거하고 준비 배지로 채워진 2mL 튜브에 수집합니다.
- 해부 완료 후 튜브를 멸균 층류 벤치로 옮기고 파파인이 함유된 1mL 소화액으로 해마 조직을 분해합니다. 1.9 - 1.10단계에서 설명한 대로 분해 용액을 준비하되 DMEM.
대신 MEM을 사용합니다.
참고: 3.9 - 3.12단계는 매우 중요하며 10 - 15분 이내에 완료해야 합니다.
- 소화가 완료되면 피펫으로 부드럽게 흡입하여 소화액을 조심스럽게 빼냅니다.
- 세척 주기당 1mL의 신선한 배양 배지를 순차적으로 첨가한 후 조심스럽게 흡인하여 뉴런 배지로 해마를 3회 세척합니다. 세포 현탁액을 원심분리하지 마십시오.
- 마지막 세척 단계 후 1mL 뉴런 배지에서 조직을 조심스럽게 분쇄합니다.
- 카운팅 챔버를 사용하여 세포를 계수하고 24웰 플레이트(3.2에서 언급한 플레이트)의 단일 웰당 500μL 뉴런 배지에 35,000개의 세포를 플레이트화합니다.
참고: 선택적으로, 세포 분취액을 트리판 블루(trypan blue)로 대조염색하여 세포 제제의 활력을 평가할 수 있습니다. 현미경을 사용하여 육안 검사를 통해 도금 밀도를 제어합니다(일반적으로 표준 10X 대물렌즈의 시야당 90 - 110 셀).
- 뉴런을 37°C, 6% v/v CO2에서 1시간 동안 인큐베이터에 넣습니다.
- 배양 후, 준비된 삽입물(confluent astrocyte monolayer로 파종됨)을 incubator에서 꺼냅니다(2.8단계 참조). 성상교세포 배지를 흡인하고 500μl의 새로운 뉴런 배지로 교체하여 배지를 교환합니다.
참고: 인서트는 2 - 3 DIV(Days In Vitro) 후에 합류하는 성상세포 단층을 보유해야 합니다.
- 멸균 집게를 사용하여 성상세포가 있는 삽입물을 뉴런 배양이 포함된 웰에 조심스럽게 놓습니다(단계 3.13).
- 생성된 간접 뉴런-성상세포 공동 배양을 37°C, 6% v/v CO2.
의 인큐베이터에 다시 넣습니다.
참고: 이러한 조건에서 뉴런은 완전히 정의된 배지에서 최대 4주 동안 배양될 수 있습니다. 중간 변경이 필요하지 않습니다. 장기간 배양의 경우 24웰 플레이트의 증발을 줄이기 위해 빈 웰에 멸균수를 채우는 것이 좋습니다.
