검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 쥐 또는 쥐 뇌 해부
참고: 마우스와 랫트 모두 사용할 수 있습니다. P8보다 나이가 많은 동물도 사용할 수 있지만(P12까지 테스트했습니다), 수막을 제거하는 것은 점점 더 어려워질 것입니다. 더욱이, 나이 든 동물의 뇌세포는 조직 해리 중에 끊어질 수 있는 복잡한 과정과 연결을 형성하여 세포 사멸을 증가시키기 때문에 세포 수율과 건강이 감소할 것입니다. 피질 제제는 여기에 설명되어 있지만 다른 뇌 영역도 사용할 수 있습니다.
- 0.05% 트립신-EDTA를 37°C 수조에 넣습니다.
- CO2 농도를 천천히 올리고 뇌를 분리하여 동물(E19 새끼의 경우 임신한 쥐 또는 P0-P8 동물)을 안락사시킵니다. 다음 단계에서는 멸균 기술이 필요합니다.
- 배아 조직을 다루는 경우, 먼저 자궁에서 배아를 제거하고 배아 주머니를 연 다음, 즉시 가위로 머리를 잘라낸다. 모든 헤드가 절단되면 예냉각된 해부 매체로 옮깁니다.
- 머리가 배지에 잠기면 집게로 피부와 두개골(둘 다 어린 동물에서는 매우 부드럽습니다)을 열고 소뇌를 꼬집습니다. 뇌의 나머지 부분을 조심스럽게 위로 들어 올려 두개골 밖으로 빼냅니다.
메모: 2-4개의 E19 배아는 해부 당일 접시당 500,000개의 세포로 도금된 피질 성상세포의 10cm 접시 8개를 위한 충분한 조직을 생성합니다.
- 갓 태어난 새끼나 그 나이가 많은 새끼의 경우 가위로 머리를 자르고 머리 뒤에서 코 끝까지 일직선으로 피부를 내측으로 잘라 뇌를 격리합니다. 피부를 옆으로 당겨 두개골을 좌우로 조심스럽게 자른 다음 두개골 뼈를 들어 올립니다. 소뇌를 잘라내고, 뇌의 나머지 부분을 두개골 밖으로 끌어올린다.
메모: 2-3마리의 P0-P8 새끼는 해부 당일 접시당 500,000개의 세포로 도금된 피질 성상세포의 10cm 접시 8개 이상에 충분한 조직을 생성합니다.
- 피질(cortex)을 기저에 있는 중뇌(midbrain) 구조로부터 분리한다. 반구 사이의 세로 균열 내에 집게를 놓은 다음 한 반구(세로 균열에 수직)의 피질과 중뇌 구조 사이로 집게를 움직여 각 반구를 자유롭게 꼬집습니다.
- 겸자를 사용하여 각 반구(및 해마)에서 모든 수막을 제거한 다음 해마를 분리합니다. 해마 성상세포가 필요한 경우 각 해마를 얼음 위의 14mL 해부 배지로 채워진 15mL 튜브로 이동합니다.
- 특정 영역이 필요한 경우 각 반구의 피질에서 더 많은 영역(예: 전두엽 피질)을 제거합니다. 성상세포를 생성하는 데 사용되는 모든 피질 조직을 1mm3 이하의 조각으로 자릅니다. 얼음 위에 박리 매체를 채운 별도의 15mL 튜브에 모든 피질 조직 조각을 모읍니다.
2. 조직 소화 및 해리
- 모든 조직 조각이 수집되면 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 다음 가능한 한 많은 배지를 흡인합니다.
- 혈청학적 피펫을 사용하여 0.05% 트립신-EDTA 2-3mL를 추가하고 37°C 수조에서 20분 동안 튜브를 배양합니다.
메모: 피펫에서 모든 트립신-EDTA를 신속하게 방출하여 조직 조각을 혼합하고 다시 침전되도록 합니다.
- 트립신-EDTA를 조심스럽게 흡인하여 조직 조각을 튜브 바닥에 가능한 한 적은 액체로 남겨둡니다.
- 예냉각된 해부 배지 5mL를 추가하여 남아 있는 트립신-EDTA를 씻어냅니다. 조직 조각의 혼합을 달성하기 위해 튜브의 상부 측면에 피펫을 넣습니다.
- 박리 매체를 흡인하고 조직 조각을 가능한 한 적은 액체에 그대로 두십시오. 예냉각된 해부 매체로 이 세척 단계를 두 번 더 반복합니다.
- 최종 세척 단계 후 1,000μL 피펫 팁을 사용하여 1mL의 DMEM+(실온으로 가열)를 추가하고 기포가 발생하지 않도록 위아래로 피펫팅하여 조직을 분쇄합니다.
메모: 기포를 생성하지 않는 것이 중요한데, 이는 성상세포가 매우 민감한 용액의 pH를 변화시킬 수 있기 때문입니다.
- 50mL 튜브의 입구에 100μm 세포 여과기를 놓고 4.5mL의 사전 냉각된 DMEM+로 필터를 미리 적십니다.
- 해리된 조직 현탁액 1mL를 세포 스트레이너에 피펫팅하고 사전 냉각된 DMEM+ 4.5mL를 더 추가하여 세포 스트레이너를 통해 세포를 세척합니다.
3. 세포 통과
- 통과 전날, 세포 배양 플레이트를 0.04% PEI로 코팅합니다.
- 해부 후 시험관(DIV) 7일차에 DMEM+ 세포가 든 10cm 접시를 인큐베이터의 실험실 셰이커에 놓고 접시를 110rpm으로 6시간 동안 흔듭니다.
- 코팅된 커버슬립에서 PEI를 탈이온화된 증류수로 두 번 씻어냅니다. 플레이트에 NB+H 배지를 추가합니다(24웰 플레이트의 경우 웰당 500μL, 6웰 플레이트의 경우 웰당 2mL). 10cm 접시가 흔들리는 동안 또는 최소 30분 동안 37°C와 5% CO2에서 인큐베이터의 플레이트를 사전 평형화합니다.
- 6시간 진탕이 끝나기 20-30분 전에 1x PBS, DMEM+, NB+H 및 0.25% 트립신-EDTA를 수조에서 37°C로 예열합니다.
- 6시간 동안 흔든 후 셰이커에서 배양 접시를 꺼내고 즉시 배지(흔들린 뉴런, 희소돌기아교세포 및 미세아교세포 포함)를 접시당 10mL 예열 1x PBS로 교체합니다.
메모: 비성상세포세포가 재부착되는 것을 방지하기 위해 분리된 세포를 포함하는 기존 배지를 즉시 흡인하는 것이 중요합니다.
- PBS를 제거하고 접시당 예열 트립신-EDTA 3mL를 추가합니다. 각 접시를 37 ° C 및 5 % CO2의 인큐베이터에서 4 분 동안 배양합니다
.
- 각 접시의 3mL 트립신-EDTA에 5mL 예열 DMEM+를 추가하고, 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 접시에서 세포를 피펫으로 분리하고, 50mL 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.
메모: 접시 바닥에서 직접 피펫 - 세포가 분리됨에 따라 접시 바닥이 더 깨끗 해져야합니다. 혈청이 트립신을 비활성화하므로 혈청이 함유된 배지(DMEM+ 대신)만 사용하십시오.
- 3,220 x g, 20°C에서 4분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 예열된 NB+H 1mL에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
4. 최종 성상세포 배양을 위한 세포 도금
- 세포를 세십시오.
- 플레이트: 6웰 플레이트의 웰당 20,000개 세포(웰당 2mL NB+H 배지) 또는 24웰 플레이트의 웰당 5,000개 세포(웰당 500μL NB+H 배지
)
- 추가 처리 또는 분석이 있을 때까지 인큐베이터의 세포 배양을 37°C 및 5% CO2로 유지합니다.
