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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 6-well MEA 및 Glass Coverslips에서 rtTA/Ngn2-positive hiPSCs와 Neuron의 분화
참고: 이 프로토콜에서는 두 개의 서로 다른 기질, 즉 6웰 MEA(웰당 9개의 기록 및 1개의 참조 내장 미세전극이 있는 6개의 독립적인 웰로 구성된 장치)와 24웰 플레이트의 웰에 있는 유리 커버슬립에서 rtTA/Ngn2 양성 hiPSC를 구별하기 위한 세부 정보가 제공됩니다. 그러나 프로토콜은 표면적에 따라 언급된 값을 확장하여 더 큰 기판(예: 12웰 또는 6웰 플레이트의 웰)에 쉽게 적용할 수 있습니다.
- MEA 또는 유리 커버슬립 준비(0일 및 1일)
- 차별화 시작 전날, 제조업체의 권장 사항에 따라 MEA를 멸균합니다.
- 접착 단백질 폴리-L-오르니틴(PLO)을 멸균 초순수에 최종 농도 50μg/mL로 희석합니다. 각 웰에 희석된 PLO를 100μL 방울 떨어뜨려 6웰 MEA의 활성 전극 영역을 코팅합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 24웰 플레이트의 웰에 커버슬립을 놓습니다. 각 웰에 희석된 PLO 800μL를 추가합니다. 1000 μL 피펫 팁으로 커버슬립을 아래로 눌러 커버슬립이 뜨는 것을 방지합니다.
- 6웰 MEA와 24웰 플레이트 O/N을 5% CO2 분위기의 가습된 37°C 인큐베이터에서 배양합니다. 다음날 희석된 PLO를 흡인합니다. 6웰 MEA의 유리 표면과 커버슬립을 멸균 초순수로 두 번 세척합니다.
- 차가운 DMEM/F12에서 라미닌을 20μg/mL(6웰 MEA의 경우) 및 10μg/mL(유리 커버슬립의 경우)의 최종 농도로 희석합니다. 각 웰에 100μL 방울을 떨어뜨려 6웰 MEA의 활성 전극 영역을 즉시 코팅합니다. 마찬가지로, 24웰 플레이트의 각 웰에 희석된 라미닌 400μL를 추가하여 커버슬립을 코팅합니다. 1,000 μL 피펫 팁으로 커버슬립을 아래로 눌러 커버슬립이 뜨는 것을 방지합니다.
- 6-well MEA와 24 well plate를 5% CO2 분위기의 가습된 37°C incubator에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
- hiPSC 플레이트(1일차)
참고: 3.2.1 - 3.2.4 단계에서 언급된 부피는 rtTA/Ngn2 양성 hiPSC가 6-well 플레이트에서 배양되고 한 well의 세포가 수확된다고 가정합니다. 6-웰 MEA 및/또는 커버슬립에서 셀을 도금하는 데 필요한 부피는 6-웰 MEA의 수 및/또는 실험에 사용되는 커버슬립의 수에 따라 다릅니다. 3.2.6 - 3.2.8단계에서 지정한 숫자를 사용하면 다양한 실험 크기로 확장할 수 있습니다.
- 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신으로 DMEM/F12, CDS 및 E8 배지를 R/T로 가열합니다. 최종 농도 4μg/mL에 독시사이클린을 추가하고 E8 배지에 ROCK 억제제를 추가합니다.
- rtTA/Ngn2 양성 hiPSC의 사용한 배지를 흡인하고 hiPSC에 1mL CDS를 추가합니다. 5% CO2 분위기의 가습된 37 °C 인큐베이터에서 3 - 5 분 동안 배양합니다. 세포가 서로 분리되어 있는지 현미경으로 확인하십시오.
- 웰에 2mL DMEM/F12를 추가하고 1,000μL 피펫으로 세포를 부드럽게 현탁시킨 다음 세포를 15mL 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액에 7mL DMEM/F12를 추가합니다. 200 x g에서 5분 동안 셀을 회전시킵니다.
- 상층액을 흡입하고 준비된 E8 배지 2mL를 추가합니다. 1,000 μL 피펫의 팁을 15 mL 튜브의 측면에 대고 세포를 부드럽게 재현탁시켜 hiPSC를 해리합니다. 현미경으로 세포가 해리되었는지 확인하십시오.
- 혈구계 챔버를 사용하여 세포 수(cells/mL)를 확인합니다.
메모: 80 - 90% 포화도의 6웰 플레이트 웰은 일반적으로 총 3.0 - 4.0 x 106개의 세포를 생성합니다.
- 희석된 라미닌을 흡인합니다. 6-well MEA의 경우 세포를 희석하여 7.5 x 105 cells/mL의 세포 현탁액을 얻습니다. 6-well MEA의 각 well에 있는 활성 전극 영역에 100μL의 세포 현탁액을 한 방울 떨어뜨려 셀을 플레이트링합니다. 커버슬립의 경우 세포를 희석하여 4.0 x 104 cells/mL의 세포 현탁액을 얻습니다. 24웰 플레이트의 웰에 500μL의 세포 현탁액을 추가하여 셀을 플레이트화합니다
메모: MEA의 최종 셀 밀도는 커버슬립보다 높습니다(그림 1A 및 B). 우리는 네트워크 활동을 적절하게 기록하기 위해 이러한 높은 세포 밀도가 필요하다는 것을 발견했습니다. 프로토콜에서는 분석에 최적화된 숫자가 제공됩니다.
- 6웰 MEA와 24웰 플레이트를 2시간(MEA) 또는 O/N(24웰 플레이트) 동안 5% CO2 분위기의 가습된 37°C 인큐베이터에 넣습니다.
- 2시간 후, 준비된 E8 배지 500μL를 6웰 MEA의 각 웰에 조심스럽게 추가합니다. 6웰 MEA O/N을 5% CO2 분위기의 가습된 37°C 인큐베이터에 놓습니다.
- 매체 변경(2일차)
- 다음날 N-2 보충제 1%(v/v), 비필수 아미노산 1%(v/v) 및 페니실린/스트렙토마이신 1%(v/v)로 DMEM/F12를 준비합니다. 인간 재조합 neurotrophin-3(NT-3)을 최종 농도 10ng/mL에, 인간 재조합 뇌 유래 신경영양인자(BDNF)를 최종 농도 10ng/mL에, 독시사이클린을 최종 농도 4μg/mL에 추가합니다. 매체를 37 ° C로 가열합니다.
- 배지에 최종 농도 0.2μg/mL까지 라미닌을 첨가합니다. 결과 매체를 필터링합니다. 6웰 MEA와 24웰 플레이트의 웰에서 사용한 배지를 흡입하고 준비된 배지로 교체합니다. 6웰 MEA와 24웰 플레이트 O/N을 5% CO2 분위기의 가습된 37°C 인큐베이터에서 배양합니다.
- 쥐 성상세포 추가 (3일차)
참고: 이 프로토콜에 언급된 부피는 쥐 성상세포가 T75 배양 플라스크에서 배양된 것으로 가정합니다. 배양에 첨가되는 쥐 성상세포의 품질이 좋은 것이 중요합니다. 우리는 쥐 성상세포의 품질이 좋은지 확인하기 위해 두 가지 기준을 사용합니다. 첫째, 쥐 성상세포 배양은 쥐 배아 뇌에서 분리된 후 10일 이내에 융합 성장할 수 있어야 합니다. 둘째, 쥐 성상세포 배양을 분할한 후 쥐 성상세포는 합류하는 테셀레이트 단층을 형성할 수 있어야 합니다(그림 1C). 쥐 성상세포 배양이 이 두 가지 기준을 충족하지 않는 경우 이 배양을 분화 실험에 사용하지 않는 것이 좋습니다.
- 0.05% 트립신-EDTA를 RT로 예열합니다.1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DPBS 및 DMEM/F12를 37°C로 예열합니다.
- 쥐 성상세포 배양의 사용된 배지를 흡인합니다. 5mL DPBS를 추가하여 배양물을 세척하고 부드럽게 휘젓습니다.
- DPBS를 흡인하고 5mL 0.05% 트립신-EDTA를 추가합니다. 트립신-EDTA를 부드럽게 휘젓습니다. 5% CO2 분위기의 가습된 37 °C 인큐베이터에서 5 - 10 분 동안 배양합니다.
- 현미경으로 세포가 분리되었는지 확인하십시오. 플라스크를 몇 번 눌러 마지막 셀을 분리합니다.
- 플라스크에 DMEM/F12 5mL를 추가합니다. 10mL 피펫으로 플라스크 내부의 세포를 부드럽게 분쇄합니다. 15mL 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다. 튜브를 200 x g에서 8분 동안 돌립니다.
- 상층액을 흡인하고 1mL의 DMEM/F12에 세포를 재현탁합니다. 혈구계 챔버를 사용하여 세포(cells/mL)의 수를 측정합니다.
- 6-well MEA의 well당 7.5 x 104 astrocyte를 추가합니다.24-well plate의 well당 2.0 x 104 astrocyte를 추가합니다. MEA와 24웰 플레이트 O/N을 5% CO2 분위기의 가습된 37°C 인큐베이터에서 배양합니다.
- 매체 변경(4일차)
- 2%(v/v) B-27 보충제, 1%(v/v) L-알라닐-L-글루타민 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신으로 neurobasal 배지를 준비합니다. 최종 농도 10ng/mL에 NT-3를 추가하고, 최종 농도 10ng/mL에 BDNF를 추가하고, 최종 농도 4μg/mL에 독시사이클린을 추가합니다. 또한 시토신 β-D-아라비노푸라노시드를 2 μM.
의 농도로 첨가합니다.
참고: 시토신 β-D-아라비노푸라노사이드를 배지에 첨가하여 성상세포 증식을 억제하고 뉴런으로 분화하지 않는 나머지 hiPSC를 죽입니다.
- 매체를 여과하고 37°C로 예열합니다. 6웰 MEA와 24웰 플레이트의 웰에서 사용한 배지를 흡입하고 준비된 배지로 교체합니다. 6웰 MEA와 24웰 플레이트를 5% CO2 분위기의 가습된 37°C 인큐베이터에서 유지합니다.
- 매체 새로 고침 (6 - 28 일)
참고: 6일차부터 2일마다 배지의 절반을 새로 고칩니다. 10일째부터는 성상세포 생존력을 지원하기 위해 배지에 FBS가 보충됩니다.
- 2%(v/v) B-27 보충제, 1%(v/v) L-알라닐-L-글루타민, 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신으로 neurobasal 배지를 준비합니다. 최종 농도 10ng/mL에 NT-3를 추가하고, 최종 농도 10ng/mL에 BDNF를 추가하고, 최종 농도 4μg/mL에 독시사이클린을 추가합니다. 10일째부터는 배지에 2.5%(v/v) FBS를 보충합니다. 생성된 매체를 여과하고 37°C로 가열합니다.
- 1000μL 피펫을 사용하여 6웰 MEA와 24웰 플레이트의 웰에서 사용한 배지의 절반을 제거하고 준비된 배지로 교체합니다. 6웰 MEA와 24웰 플레이트를 5% CO2 분위기의 가습된 37°C 인큐베이터에서 유지합니다.
