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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 행잉 드롭 배양으로서의 뉴런 볼의 준비 (Days in vitro (DIV) 0-3)
참고: 뉴런 볼 배양 준비를 위해 여기에 설명된 절차는 이전에 Sasaki 그룹에 의해 보고된 방법을 기반으로 합니다. 우리는 또한 해리 문화에 대한 Banker 방법의 몇 가지 절차를 채택했습니다.
- 해부를 시작하기 전에 다음 사항을 확인합니다.
- 필요한 모든 용액을 준비하고 사전에 오토클레이브/여과로 살균하십시오.
- 이 피질 뉴런 배양의 각 단계에서 사용할 모든 도구와 재료를 준비하십시오.
- 층류 공기 흐름 캐비닛, 해부 테이블, 스테이지 플레이트, 실체 현미경, 가위 및 집게에 70% 에탄올을 뿌리고 닦습니다.
- CO2 적용 시 마우스를 안락사시키고 복부를 해부하여 E16 배아를 얻습니다.
- 집게의 미세한 끝을 사용하여 배아에서 뇌를 조심스럽게 제거하고 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 4mL, HEPES 완충염 용액(HBSS)을 포함하는 60mm 세포 배양 접시에 옮깁니다.
메모: 해부 매체 HBSS는 10mM HEPES (pH 7.4), 140mM 염화나트륨 (NaCl), 5.4mM 염화칼륨 (KCl), 1.09mM 인산이수소나트륨 (Na2HPO4 ), 1.1 mM 인산이수소 칼륨 (KH2PO4 ), 5.6 mM D-글루코스 및 5.64 μM 페놀 레드를 포함한다.
- 두피를 제거하고, 후각구를 잘라내고, 실체현미경으로 집게의 미세한 끝을 사용하여 각 대뇌 반구의 피질을 분리하고, 신선한 HBSS가 들어 있는 다른 60mm 접시에 옮깁니다. 각각의 개별 뉴런 볼 배양에 대해 최소 3-5개의 배아를 사용합니다.
- 층류 세포 배양 후드에서 미세 해부 스프링 가위로 피질을 작은 조각으로 자릅니다.
- 다진 피질을 15mL 튜브로 옮기고 37°C의 수조에서 4.5분 동안 HBSS의 0.125% 트립신 4mL에 다진 피질을 트립신화합니다.
메모: 이 트립신화 시간은 증가하는 시간(> 4.5분)으로 인해 더 많은 사(dead neuron)가 발생하기 때문에 효율적인 뉴런 배양에 매우 중요합니다.
- 멸균 이송 피펫을 통해 10mL의 HBSS가 들어 있는 새로운 15mL 튜브로 세포 응집체를 옮기고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 세포 응집체를 GlutaMax, B27 보충제(NGB 배지), 0.01% DNase I 및 10% 호스 혈청을 함유한 2mL의 Neurobasal 배지가 들어 있는 새로운 15mL 튜브로 옮깁니다.
불로 연마된 고급 - 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 위아래로(3-5회) 반복적으로 피펫팅하여 트립신화된 피질을 삼중화합니다.
메모: 불로 연마 된 고급 유리 파스퇴르 피펫의 직경은 Banker method 논문에 설명 된대로 매우 중요합니다. 피펫이 너무 좁아서 피질을 통과할 수 없는 경우 2-3가지 크기의 피펫을 준비하고 더 큰 피펫에서 시도하십시오.
- 뉴런 볼을 준비하기 위해 위의 세포 현탁액을 취하고 NGB 배지를 사용하여 세포 밀도를 1 x 106 cells/mL로 조정합니다.
- 10cm 배양 접시의 상부 뚜껑 내부에 10,000개의 세포/방울(1방울은 10μL)을 포함하는 매달린 방울로 피질 뉴런을 배양합니다.
- 배양 접시의 바닥 부분에 인산염 완충 식염수(PBS) 7mL를 추가한 다음 뉴런 볼이 형성될 수 있도록 가습 조건에서 5% CO2로 3°C에서 3일 동안 인큐베이터에 보관합니다.