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1. 해리된 성체 등뿌리 신경절 뉴런 또는 DRG 뉴런의 배양 준비
- 배양을 설정하기 전에 6웰 플레이트에 poly-D-lysine과 laminin을 사전 코팅합니다. 0.01% 폴리-D-라이신이 함유된 6-웰 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 증류수로 접시를 두 번 씻습니다.
- 실온에서 2시간 동안 3μg/mL 농도의 라미닌 용액으로 플레이트를 배양한 다음 증류수로 플레이트를 두 번 세척합니다. 접시를 실온에서 최소 1시간 동안 건조시킵니다.
- 압축된 CO2 가스 실린더에 연결된 투명한 CO2 챔버에서 마우스를 안락사시킵니다. 수술용 칼날로 척추 위의 피부를 절개하고 척추주위 근육을 양측으로 절개하여 척추뼈를 노출시킵니다. DRG가 완전히 노출될 때까지 끝이 좁은 수술용 롱거를 사용하여 척추뼈를 꼼꼼하게 제거합니다.
메모: 성체 DRG 뉴런은 생후 8주에서 12주 사이의 성체 C57BL6 수컷 마우스에서 얻습니다.
- 홍채 절제술 가위와 해부 현미경으로 끝이 가는 집게를 사용하여 S1에서 C1 수준까지 DRG를 양측으로 제거합니다. 슈반 세포 또는 섬유아세포의 오염을 최소화하기 위해 DRG에서 뿌리를 완전히 잘라내십시오.
- 아직 남아 있는 DRG가 채취되더라도 모든 DRG가 다음 단계가 될 때까지 얼음 위에 차가운 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 5mL가 들어 있는 60mm 페트리 접시에 절개된 DRG를 보관하십시오.
메모: DRG를 가능한 한 빨리 해부하는 것이 중요합니다. 안락사 후 한 마우스에서 모든 DRG를 채취하는 데 30분 이상 걸리지 않아야 하며, DRG 채취를 중지하고 말단이 절단된 파란색 피펫 팁(1000 μL)을 사용하여 DRG를 1.5 mL Eppendorf tube로 이송합니다. 미니 원심분리기를 사용하여 몇 초 동안 빠르게 회전한 후 DMEM을 제거합니다. 125 U/mL type XI 콜라겐분해효소가 함유된 DMEM 1mL를 추가하고 37°C 인큐베이터에서 트위스터 쉐이커를 사용하여 완만한 회전(35-40 rpm)으로 90분 동안 튜브를 배양합니다. 테이프를 사용하여 셰이커 바닥에 튜브를 고정합니다.
- 콜라겐분해효소 함유 DMEM을 버리고 새로운 DMEM 1mL를 추가합니다. 떠 있는 DRG가 바닥으로 완전히 가라앉을 때까지 기다린 다음 조직 파편이 있는 DMEM을 제거합니다. 이 세척 단계를 최소 6회 반복합니다.
메모: 상등액을 완전히 버리려고 하지 마십시오. 상층액 DMEM으로 DRG를 제거하지 않도록 주의하십시오.
- 절단 끝이 있는 파란색 피펫 팁(1000μL)을 사용하여 DRG를 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 파란색 팁(1000μL)을 사용하여 15회 이상 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 균일한 세포 현탁액을 만듭니다. 거품을 만들지 말고 피펫 팁으로 원뿔형 튜브의 바닥을 만지지 마십시오.
- 239 x g에서 튜브를 3분 동안 원심분리하고 떠다니는 파편이 있는 상층액을 조심스럽게 버립니다. B27(2.0% v/v)이 보충된 Neurobasal 배지 1mL를 추가하고 5-10회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 50mL 원뿔형 튜브 위에 겹쳐진 70μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다. 2분 동안 기다린 다음 피펫 컨트롤러를 사용하여 Neurobasal/B-27 배지를 스트레이너에 붓습니다.
- 수집된 모든 DRG 뉴런(한 마우스의 약 2 x 106 DRG 뉴런)을 6웰 플레이트의 두 웰에 플레이트합니다. 성체 마우스 한 마리의 DRG 뉴런은 6웰 플레이트에 있는 두 개의 웰을 덮고 있습니다. 그런 다음 대식세포가 공동 배양될 때까지 37°C의 CO2 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.
2. 세포 배양 삽입물에서 1차 복막 대식세포의 공동 배양
참고: 해리된 DRG 뉴런의 초기 도금 후 4시간 후에 공동 배양을 설정합니다.
- 1차 복막 대식세포는 생후 8주에서 12주 사이의 성체 C57BL6 수컷 마우스에서 제조됩니다. CO2 챔버에서 동물을 안락사시킵니다. 복부 피부를 섬세하게 절개하고 복막을 노출시키며 복막을 절단하지 않도록 세척액의 누출을 방지합니다.
- 22G 바늘이 달린 주사기를 사용하여 복막에 구멍을 뚫고 10mL의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)를 복강에 주입합니다. 1-2분 동안 복막을 부드럽게 마사지합니다. 그런 다음 바늘을 빼내고 바늘 천공 부위를 통해 PBS를 짜내고 세척액을 50mL 원추형 튜브에 모읍니다.
메모: 사용하기 전에 PBS의 차가움을 유지하기 위해 주사기를 얼음 위에 올려 놓으십시오.
- 세척액을 239 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 성분을 펠릿화합니다. 펠릿을 적혈구(RBC) 용해 완충액 3mL로 실온에서 3분 동안 재현탁합니다. 그런 다음 4°C에서 10분 동안 239 x g에서 세포 현탁액을 다시 원심분리합니다. 펠릿을 PBS 3mL로 재현탁하고 세포 현탁액을 다시 원심분리하여 남아 있는 적혈구 용해 완충액을 제거합니다.
메모: RBC 용해 완충액이 완전히 제거되었는지 확인합니다. 그렇지 않으면 잔류 RBC 용해 완충액이 배양된 대식세포에 독성을 가질 수 있습니다.
- 펠릿화된 세포를 1mL의 Neurobasal/B-27 배지에 재현탁합니다. 수집된 모든 대식세포의 절반(총 3개 × 106 - 6 x 106 세포)을 4.2cm2의 유효 면적을 가진 세포 배양 삽입물에 플레이트를 만들고 해리된 DRG.
의 웰 위에 놓습니다.
메모: 공동 배양 기간 동안 대식세포는 Neurobasal/B-27 뉴런 배양 배지에서 성장합니다. 이 조건 하에서 대식세포의 적절한 생존이 확인되었다.
3. db-cAMP (dibutyryl-cyclic AMP)의 처리 및 대식 세포 CM의 수집
참고: 뉴런-대식세포 공동 배양 후 4시간 후에 db-cAMP 치료를 시작합니다.
- 2μL의 100μM db-cAMP 용액을 뉴런-대식세포 공동 배양에 추가합니다. 대조 실험을 위해 동일한 부피의 PBS를 추가합니다.
- 24시간 후, 동일한 6-well 플레이트에 1mL의 대식세포 배양 배지로 빈 웰을 채웁니다. 뉴런-대식세포 공동 배양에 삽입된 세포 배양 삽입물을 대식세포 배양 배지를 사용하여 빈 웰로 옮깁니다. 매체를 변경하지 않고 72시간 동안 셀을 동일한 상태로 유지하십시오.
메모: 농축된 CM을 만들기 위해 CM 수집 중에 대식세포 배양 배지를 1mL만 첨가합니다. CM 수집 중에 필요한 경우 인서트 내의 대식세포를 완전히 덮기 위해 더 많이 추가했습니다.
- 72시간 후, 대식세포 CM을 239 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 성분을 제거합니다. 상층액을 0.2μm 필터에 통과시켜 남아 있는 세포 파편을 제거합니다. 수집된 CM은 사용할 때까지 -70°C에서 보관하십시오.