뉴런 확장을 촉진하기 위해 대식세포 조건 배지를 사용합니다.

초록

출처: Yun, H. J., et al. Neurite Outgrowth Activity로 분자 인자를 분비하는 대식세포를 활성화하기 위한 Neuron-Macrophage 공동 배양. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 대식세포 조건 배지를 사용하여 신경돌기 성장으로 알려진 뉴런 돌출부의 성장을 촉진하기 위한 분석을 보여줍니다. cAMP와 함께 뉴런과 대식세포를 공동 배양하고 대식세포 유래 조건화된 배지를 수확합니다. 조건화된 배지로 뉴런을 성장시키면 신경돌기 성장이 촉진됩니다. 이러한 파생물은 형광 표지되고 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

프로토콜

1. db-camp의 치료 및 대식 세포 조건 매체 수집

참고: 뉴런-대식세포 공동 배양 후 4시간 후에 db-cAMP 치료를 시작합니다.

1. 2μL의 100μM 디부티릴 고리형 AMP(db-cAMP) 용액을 뉴런-대식세포 공동 배양에 추가합니다. 대조 실험을 위해 동일한 부피의 인산염 완충 살린(PBS)을 추가합니다.
2. 24시간 후, 동일한 6-well 플레이트에 1mL의 대식세포 배양 배지로 빈 웰을 채웁니다. 뉴런-대식세포 공동 배양에 있는 세포 배양 삽입물을 대식세포 배양 배지를 가진 빈 우물에 옮깁니다. 매체를 변경하지 않고 72시간 동안 셀을 동일한 상태로 유지하십시오.
   메모: 농축된 CM을 만들기 위해 컨디셔닝 배지(CM) 수집 중에 1mL의 대식세포 배양 배지만 추가합니다. CM 수집 중에 필요한 경우 인서트 내의 대식세포를 완전히 덮기 위해 더 많이 추가했습니다.
3. 72시간 후, 대식세포 CM을 239 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 성분을 제거합니다. 상층액을 0.2μm 필터에 통과시켜 남아 있는 세포 파편을 제거합니다. 수집된 CM은 사용할 때까지 -70°C에서 보관하십시오.

2. 수집된 CM을 사용한 신경관 성장 분석

1. 별도의 성체 DRG 뉴런 배양을 설정하기 전에 8웰 챔버 슬라이드에 poly-D-lysine 및 laminin을 사전 코팅합니다. 0.01% 폴리-D-라이신이 함유된 6-웰 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 증류수로 접시를 두 번 씻습니다.
2. 실온에서 2시간 동안 3μg/mL 농도의 라미닌 용액으로 플레이트를 배양한 다음 증류수로 플레이트를 두 번 세척합니다. 접시를 실온에서 최소 1시간 동안 건조시킵니다.
3. B27이 보충된 Neurobasal 배지에서 해리된 성인 DRG 뉴런을 얻습니다. 5 x 10^{웰당 4}개의 셀을 사전 코팅된 8웰 챔버 슬라이드에 플레이트합니다.
4. 챔버 슬라이드를 37°C 인큐베이터에 2시간 동안 놓고 세포가 바닥에 부착되도록 합니다. 그런 다음 배양 배지를 37 ° C.
   로 예열 된 해동 된 CM으로 교체하십시오. 메모: 배양액을 제거하고 수집된 CM을 추가할 때 8-well 챔버 슬라이드의 바닥을 만지지 않도록 주의하십시오.
5. 초기 도금 후 15 시간 후에 매체를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 웰에 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 용액 200μL를 추가하고 4°C
   에서 20분 동안 파라포름알데히드 용액으로 세포를 배양합니다. 메모: 신경돌기 성장 분석을 위한 DRG 뉴런 배양은 정확히 15시간으로 제한되어야 합니다. 이 상태에서는 눈에 띄는 신경돌기 성장이 없습니다.
6. 얼음처럼 차가운 PBS로 3회 세척한 다음 10% 일반 염소 혈청(NGS)과 0.1% Triton-X로 30분 동안 차단을 수행합니다.10% NGS(1μg/mL 농도)로 희석된 1차 항체(anti-Tuj-1) 용액으로 실온에서 4시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.
7. PBS로 3회 세척한 다음 실온에서 2시간 동안 2차 항체(goat-anti mouse) 용액으로 세포를 배양합니다. 그런 다음 PBS로 2회 세척하고 장착 용액을 사용하여 커버슬립(24 × 50mm)으로 배양 슬라이드를 장착합니다.
8. 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하여 신경돌기 성장을 시각화합니다(그림 1).

결과

그림 1: 다양한 조건에서 얻은 조건화된 배지를 사용한 신경돌기 성장 분석의 대표적인 결과. (가, 나) 성체 DRG 뉴런을 급성으로 해리시키고 정확히 15시간 동안 배양한 후 2시간 후, 배양 배지를 PBS(A) 또는 디부티릴 cAMP(db-cAMP)(B)로 처리한 뉴런-대식세포 공동 배양에서 얻은 컨디셔닝 배지(CM)로 교체했습니다. db-cAMP로 처리된 CM만이 강력한 신경돌기 성장 활성을 나타냈습니다. (C, D) db-cAMP로 처리된 대식세포(C) 또는 뉴런(D) 단독으로 구성된 배양물에서 얻은 CM은 신경돌기 성장을 지원하지 않았습니다. 눈금 막대는 200μm를 나타냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포 배양 인서트 투명 PET 멤브레인 0.4μm 기공 크기	코닝, 팔콘	353090	0.4μm 공극 크기의 투명 PET 멤브레인, 6웰 플레이트용
70μm 나일론 셀 스트레이너	코닝, 팔콘	352350
8-웰 배양 슬라이드	바이오코트	354632	Poly-D-Lysine의 균일한 적용으로
Neurobasal 배지	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), Gibco	제21103-049	1% 글루타맥스와 1% 페니실린-스트렙토마이신 함유
B-27 보충제, 무혈청	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), Gibco	제17504-044	세포외 솔루션
글루타맥스	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), Gibco	제35050-061
페니실린-스트렙토마이신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), Gibco	15140-122
Poly-D-lysine 하이드로 브로마이드	시그마-알드리치	P6407-5MG
라미닌	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	23017-015
아데노신 3', 5'-고리형 모노포스페이트, N6,O2'-디부티릴-, 나트륨 염	머크 밀리포어 코퍼레이션, Calbiochem	28745
10% 노멀 염소 세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	16210072
트리톤-X-100	대정화학금속(주	8566-4405
안티 β III 튜불린 (Tuj-1)	프로메가 코퍼레이션	G7121	마우스 단클론 항체
염소 항-마우스 IgG (H+L) 2차 항체	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A11005
혈구계	마리엔펠트-수페리어	해당 사항 없음
세포 배양 CO2 인큐베이터	파나소닉	해당 사항 없음
탁상용 원심분리기	소르발	해당 사항 없음
컨포칼 현미경	올림푸스 아메리카 Inc	익스71
FBS (소태아 혈청)	VWR 인터내셔널, 하이클론	SH30919.03