Tracking Axonal Transport of Organelles in Motor Neurons Using a Microfluidic Device

초록

출처: Altman, T., et al. Microfluidic Chambers System을 사용한 운동 뉴런 배양에서 소기관의 축삭 수송. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 미세유체 챔버 시스템을 사용하여 운동 뉴런의 축삭 수송을 추적하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 축삭 성장을 유도하기 위해 영양 배지가 있는 폴리머로 코팅된 웰에서 마우스 배아 척수 조직을 배양하는 것이 포함됩니다. 라이브 이미징에서 형광 염료 염색 소기관의 움직임은 양방향 축삭 수송을 확인합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 미세유체 챔버 또는 MFC 준비

1. 1차 금형의 PDMS 주조(그림 1)
   1. 세부 프로토콜에 따라 기본 금형(웨이퍼)을 구매하거나 생성합니다.
   2. 코팅 단계를 진행하기 전에 가압 공기를 사용하여 웨이퍼 플랫폼에서 모든 유형의 먼지를 제거하십시오. 웨이퍼의 표면은 매끄럽고 투명하게 보여야 합니다.
   3. 용기에 액체 질소 50mL를 채웁니다. 10mL 주사기와 23G 바늘을 준비합니다.
      메모: 이 단계 이후의 모든 절차는 화학 후드에서 수행해야 합니다.
   4. 화학 물질 후드에서 주사기와 바늘을 사용하여 2mL의 액체 질소를 모읍니다. 공기를 빨아들인 것처럼 보일지 모르지만 주사기는 질소로 채워져 있습니다(그림 1A). 웨이퍼 함유 플레이트를 밀봉 가능한 용기에 넣습니다.
   5. 클로로트리메틸실란 병을 나사로 열고 질소로 채워진 주사기를 사용하여 고무 캡을 뚫고 주사기의 내용물을 모두 병에 주입합니다. 바늘을 뽑지 않고 병을 거꾸로 뒤집어 클로로트리메틸실란 2mL를 다시 뽑습니다.
      메모: 주사기 압력 때문에 소량의 클로로트리메틸실란이 바늘에서 분사됩니다. 위험을 방지하려면 바늘이 후드의 내벽 쪽을 향하도록 하십시오(그림 1B).
   6. 클로로트리메틸실란을 용기에 균일하게 펴 바르되(단계 1.1.4부터), 웨이퍼 또는 웨이퍼 함유 플레이트에 직접 펴 바르지 마십시오. 용기를 닫고 웨이퍼당 5분 동안 배양합니다.
      메모: 웨이퍼를 클로로트리메틸실란으로 코팅하는 것이 처음인 경우 각 웨이퍼에 대해 1시간의 배양을 허용해야 합니다.
   7. 30분 동안 화학 물질 후드에서 웨이퍼와 용기를 꺼내지 마십시오.
      주의: 클로로트리메틸실란은 휘발성이 높습니다.
   8. 50mL 튜브에서 PDMS 염기(재료 표 참조)의 무게를 측정하고 PDMS 경화제를 각각 16:1의 비율로 첨가합니다(예: 염기 47.05g 및 경화제 2.95g). 저속 로테이터를 사용하여 10분 동안 믹싱합니다.
   9. PDMS를 각 웨이퍼 포함 플레이트에 원하는 높이로 붓습니다(그림 1C).
      메모: 얇은 미세유체 챔버(최대 3-4mm)를 사용하면 배양 접시에 대한 접착력이 향상되고 누출을 방지할 수 있습니다.
   10. 모든 플레이트를 진공 데시케이터 내부에 2시간 동안 함께 놓습니다(그림 1E). 이 프로세스는 PDMS 내에 갇힌 공기를 제거하여 기포를 제거하고 투명하고 균일한 금형을 형성합니다.
   11. 접시를 70°C에서 3시간(또는 밤새) 동안 오븐에 넣습니다(그림 1E).
       메모: 접시는 오븐에 넣을 때 수평이 되어야 합니다.
2. 에폭시 주형의 PDMS 주조
   메모: 웨이퍼 준비는 비용이 많이 들고 특수 장비가 필요하며 깨지기 쉬운 웨이퍼를 손상시킬 수 있기 때문에 웨이퍼의 에폭시 복제품을 생성할 수 있습니다. 복제품은 더 저렴하고 내구성이 뛰어나며 미세유체 챔버의 대량 생산에 사용할 수 있습니다.
   1. PDMS(1.1.8-1.1.11에 설명된 대로)를 원래 웨이퍼에 캐스팅 및 경화합니다.
   2. PDMS의 과잉 부분을 제거하고 잘라내고, 미세유체 원소와 미세유체 챔버로 그것들을 처리하는 데 필요한 기능 영역만 남깁니다.
   3. PDMS에 먼지가 쌓이지 않도록 즉시 두껍고 끈적한 테이프로 감쌉니다.
   4. 내부의 전체 PDMS에 맞는 조직 배양 등급 플라스틱 접시를 선택하고 그 주위에 에폭시를 위한 공간을 남겨 두십시오. PDMS에서 플라스틱 접시까지의 거리는 5mm 미만이어야 합니다.
   5. 10:1의 비율로 혼합된 소량의 PDMS를 준비합니다(염기: 경화제). 신선한 액체 PDMS는 고체 PDMS를 플라스틱 판 바닥에 붙이는 데 사용됩니다.
   6. 플라스틱 플레이트의 중앙 바닥에 최소한의 액체 PDMS를 적용한 다음 PDMS에서 끈적한 테이프를 제거하고 플라스틱 접시 바닥에 부착합니다. 미세유체 요소가 위쪽을 향하고 있는지 확인하십시오.
   7. PDMS를 70°C 오븐에서 30분 동안 경화시킵니다.
   8. 시험관에 베이스와 경화제를 각각 100:45의 비율로 혼합하여 에폭시 수지를 준비합니다. 에폭시 수지마다 혼합 비율이 다를 수 있습니다. 일반 100mm 플레이트에 필요한 부피는 약 40mL입니다.
   9. 혼합물이 눈에 띄게 균질해질 때까지(즉, 액체에 눈에 띄는 섬유와 같은 인공물이 없을 때까지) 로테이터에서 에폭시를 10분 동안 잘 혼합합니다.
   10. 에폭시 혼합물을 400 x g에서 5분 동안 원심분리하여 내부에 걸린 기포를 제거합니다.
   11. 원심분리하는 동안 벽과 배양 접시의 다른 모든 노출된 플라스틱 부분 주위에 실리콘 그리스의 얇은 층을 펴 바릅니다. 이렇게 하면 에폭시가 접시 플라스틱과 중합되는 것을 방지하고 프로토콜이 끝날 때 경화된 에폭시를 쉽게 제거할 수 있습니다.
   12. 에폭시가 PDMS를 완전히 덮고 최소 5mm 이상 넘어갈 때까지 에폭시를 접시에 천천히 붓습니다. 튜브와 플레이트 사이의 거리를 0으로 유지하여 에폭시 내부에 기포가 형성되는 것을 방지합니다. 다음 48시간 동안 움직이지 않도록 접시를 안전한 장소에 놓으십시오.
   13. 48 시간 후에 에폭시가 완전히 경화되어야합니다. 최종 경화를 위해 80°C로 예열된 오븐에 플레이트를 3시간 동안 삽입합니다.
   14. 플레이트의 플라스틱 벽이 깨질 때까지 부드럽게 잡아당겨 플레이트와 원래 PDMS 몰드에서 경화된 에폭시를 제거합니다. 그런 다음 에폭시에서 쉽게 분리되어 벗겨져야 합니다.
   15. 추출이 완료되면 새 에폭시 복제품에서 남은 그리스를 닦아내고 거꾸로(즉, 복제된 미세유체 원소가 위를 향하도록) 새 배양 접시에 삽입합니다. 이제 에폭시 복제품이 PDMS 주조를 위한 준비가 되었습니다.
   16. 압축 공기 또는 N2를 사용하여 에폭시 주형에서 PDMS의 잔여물이나 먼지를 불어내고 이소프로판올로 2번 헹굽니다. 세 번째로 채우고 오비탈 셰이커 플레이트에서 10분 동안 배양합니다. 이소프로판올로 금형을 다시 3번 헹구고 남은 액체를 버립니다. 공기 또는 N2로 불어 말리거나 마를 때까지 70 °C 오븐에 넣습니다.
       메모: 이소프로판올로 작업하거나 폐기할 때 안전 절차를 따르십시오.
   17. 주조할 때까지 금형 플레이트를 닫아 두십시오. 1.1.8.-1.1.11 단계를 따릅니다.
3. PDMS를 MFC로 펀칭 및 스컬프팅(그림 2)
   1. 메스를 사용하여 웨이퍼의 (+) 표시를 따라 플레이트에서 PDMS 금형을 절단하고 제거합니다. 금형은 깨지기 쉬우므로 힘을 가하지 마십시오(그림 2A).
   2. 스케치에 그려진 지침에 따라 실험 설정에 따라 챔버를 펀칭하고 자릅니다(그림 2B-F).
      1. 척수 이식 배양(그림 2C, E)을 위해 대형 MFC의 원위부에 7mm 웰 2개를 펀칭합니다. 채널 가장자리와 겹치는 방식으로 우물을 찾습니다. 근위부에서는 채널 중간에 7mm 웰 하나를 펀칭하고 겹침을 최소화하여 외식을 위한 충분한 공간이 남도록 합니다. 근위 채널의 두 가장자리에 두 개의 추가 1mm 구멍을 뚫습니다. 미세유체 원소가 위를 향하도록 MFC를 돌리고 20G 바늘을 사용하여 펀칭된 7mm 웰에 3개의 작은 외식 동굴을 조각합니다.
      2. 해리된 MN 배양(그림 2D, F)의 경우 소형 MFC의 두 채널 가장자리에 6mm 웰 4개를 펀칭합니다.
4. 조직 배양용 MFC 살균
   1. 벤치에 50cm 길이의 접착 테이프 밴드를 펼칩니다. 챔버를 누르고 뒤로 당겨 접착 테이프(위쪽 및 아래쪽 면 모두)를 향하게 하고 조잡한 먼지를 제거합니다. 깨끗한 챔버를 새 15cm 플레이트에 놓습니다.
      메모: 미세유체 요소가 위쪽을 향할 때 직접 누르지 마십시오.
   2. 오비탈 쉐이커에서 10분 동안 분석 등급 70% 에탄올로 챔버를 배양합니다.
   3. 에탄올을 폐기하고 조직 배양 후드 또는 70°C의 오븐에서 챔버를 건조시킵니다.
5. 유리 바닥 접시에 MFC를 놓습니다.
   1. 조직 배양 등급 35mm/50mm 유리 바닥 접시의 중앙에 챔버를 놓고 가장자리에 약간의 힘을 가하여 PDMS와 접시 바닥이 바인딩되도록 합니다. 유리 바닥이 깨지지 않도록 항상 단단한 표면 위에 힘을 가하십시오.
   2. 70 °C에서 10분 동안 배양합니다.챔버를 눌러 플레이트에 대한 접착력을 강화합니다.
   3. 자외선 아래에서 10분 동안 배양합니다.
6. 코팅 및 배양
   1. 두 격실에 1.5ng/mL 폴리-L-오르니틴(PLO)을 추가합니다. 채널 입구에서 직접 코팅 매체를 몇 번 피펫팅하여 PLO가 채널을 통과하고 있는지 확인하십시오.
   기
   2. 포의 존재 여부를 확인하기 위해 10배 배율의 광학 현미경으로 미세유체 챔버를 검사합니다. 기포가 마이크로 홈을 막고 있으면 MFC를 진공 데시케이터에 2분 동안 넣습니다. 나중에 코팅 매체를 통해 피펫팅하여 채널에 걸린 과도한 공기를 제거하십시오. 하룻밤 동안 배양하십시오.
   3. PLO를 라미닌(DDW에서 3μg/mL)으로 대체하여 동일한 방식으로 야간 배양을 합니다.
   4. 도금하기 전에 라미닌을 신경 배양 배지로 세척하십시오.

2. 신경 세포 배양 도금

1. 척수 이식 배양
   1. 곧은 가위와 가는 집게를 사용하여 E12.5 ICR-HB9:GFP 마우스 배아에서 척수를 절개합니다. 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)이 포함된 1X HBSS 용액에서 작업합니다(그림 3A-C).
   2. 현미해부 가위를 사용하여 수막과 등쪽 뿔을 제거합니다(그림 3D).
   3. 척수를 1mm 두께의 가로 부분으로 자릅니다(그림 3E). MFC의 근위 구획에서 모든 매체를 폐기합니다.
   4. 총 부피 4μL의 피펫으로 단일 척수 절제술을 집어 듭니다. 외식물을 동굴에 최대한 가깝게 주입하고 측면 배출구(1mm 펀치)를 통해 근위 웰에서 과도한 액체를 빼냅니다. 외식은 근위 채널로 빨려 들어가야 합니다.
   5. 150μL의 척수 이식 배지(SCEX, 재료 표 및 표 3 참조)를 근위 웰에 천천히 추가합니다.
   6. 척수 이식 배양 유지 관리
      1. 근위 구획에 SCEX 배지를 추가하고 원위 구획에 풍부한 SCEX 배지(50ng/mL의 BDNF 및 GDNF를 함유한 SCEX)를 추가합니다. 원위 웰(더 높은 부피)과 근위 웰 사이의 웰당 최소 15μL의 부피 구배를 유지합니다.
      2. 2일마다 매체를 새로 고칩니다. 축삭돌기가 원위부로 교차하는 데 최대 3-5일이 걸릴 수 있습니다.

3. 축삭 수송(그림 4A)

1. 미토콘드리아와 산성 구획의 라벨링
   1. 100 nM Mitotracker Deep Red FM 및 100 nM LysoTracker Red를 함유하는 새로운 SCEX 배지(또는 해리된 MN의 경우 CNB)를 준비합니다. 37 °C에서 30-60분 동안 배양합니다. 형광단이 겹치지 않는 한 다른 색상을 사용할 수 있습니다.
   2. 따뜻한 CNB/SCEX 배지로 3회 세척합니다. 플레이트는 이미징 준비가 되었습니다.
2. 라이브 이미징
   1. 3초 간격으로 영화당 총 5분씩 축삭 이동에 대한 100개의 타임랩스 이미지 시리즈를 획득합니다.
      메모: 이 연구에 사용된 이미징 시스템에는 독점 세포 이미징 소프트웨어를 통해 제어되는 회전 디스크 컨포칼이 장착된 도립 현미경, 60x 오일 렌즈, NA = 1.4 및 EMCCD 카메라가 포함되었습니다. 동영상은 37°C 및 5% CO₂.
      의 통제된 환경에서 획득했습니다. 메모: 실험에 따라 더 길거나 더 짧은 타임랩스 동영상을 이미지화할 수 있습니다. 필요한 경우 하룻밤 영화도 녹화할 수 있습니다. 그러나 영화 획득 중 광독성과 표백을 줄이기 위해 노출 시간과 레이저 출력, 총 이미지 수를 줄이는 것이 중요합니다.

결과

그림 1: 실리콘 몰드 준비. 클로로트리메틸실란 웨이퍼 세척 절차를 설명하는 개략도. (A) 먼저 액체 질소 50mL를 적절한 용기에 넣었습니다. 화학 후드에서 작업하면서 주사기와 바늘을 사용하여 8mL의 액체 질소를 추출했습니다. 주사기의 전체 내용물을 클로로트리메틸실란 병에 주입했습니다. 뚜껑이 아래를 향하도록 병을 뒤집고 8mL의 클로로트리메틸실란을 다시 당겨 넣었습니다. (B) 클로로트리메틸실란이 용기에 퍼져 있습니다(웨이퍼에 직접 노출되지 않음). 용기를 닫은 다음 각 금형에 대해 5분 동안 배양해야 합니다. (C) 액체 PDMS를 원하는 높이까지 각 웨이퍼에 부었다. (D) 모든 플레이트를...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 불소 – 유리 바닥 접시	월드 정밀 기기 WPI	FD35-100
50mm Fluodish – 유리 바닥 접시	월드 정밀 기기 WPI	FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD 카메라	안도르
ARA-C(시토신 β-D-아라비노푸라노시드)	시그마-알드리치	C1768	필터링된 DDW에 2mM 재고
B-27 보충제(50X)	써모 피셔	17504044
증권 시세	알로몬 연구소	나-250	0.01% BSA로 여과된 ddw에서 10 μg/mL로 희석)
생검 펀치 1.25mm	월드 정밀 기기 WPI	504530	대형 MFC를 준비하기 위해
생검 펀치 6mm	월드 정밀 기기 WPI	504533	소형 MFC 준비용
생검펀치 7mm	월드 정밀 기기 WPI	504534	대형 MFC를 준비하기 위해
Bitplane Imaris 소프트웨어 - 버전 8.4.1	이마리스
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	#A3311-100G	DDW에서 5% w/v
클로로트리메틸실란	시그마-알드리치	#386529-100ML
증권 시세	알로몬 연구소	C-240	0.01% BSA로 여과된 ddw에서 10 μg/mL로 희석)
밀도 그라디언트 매체 - Optiprep	시그마-알드리치	D1556
소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease I(DNAse)	시그마-알드리치	DN-25	neurobasal에 있는 주식 10mg/mL
Dow Corning 고진공 실리콘 그리스	시그마-알드리치	Z273554-1개	에폭시 금형 준비용
DPBS 10배	써모 피셔	#의 14200-067	DDW에서 1:10을 희석합니다.
뒤몽 파인 펜치 # 55 0.05 × 0.02 mm	F.S.T	1125520
에폭시 경화제	트리아스 켐 S.R.L	아이피 743	에폭시 금형 준비용
에폭시 수지	트리아스 켐 S.R.L	RP 026UV	에폭시 금형 준비용
FIJI 소프트웨어	이미지J
지그엔프	알로몬 연구소	G-240	0.01% BSA로 여과된 ddw에서 10 μg/mL로 희석)
글루타맥스 100X	써모 피셔	#의 35050-038
HB9 : GFP 마우스 균주	잭슨 연구소	5029
HBSS 10배	써모 피셔	#의 14185-045	1% P/S를 첨가하고 필터를 추가하여 ddw에서 1:10으로 희석
iQ 소프트웨어	안도르
아이리스 가위, 곡선형, 10 cm	AS 메디진테크닉	제11-441-10
아이리스 가위, 스트레이트, 9 cm	AS 메디진테크닉	제11-440-09
라미닌	시그마-알드리치	#L-2020
레보비츠의 L-15 미디엄	써모 피셔	11415064
라이소트래커 레드	써모 피셔	L7528
Mitotracker 딥 레드 FM	써모 피셔	M22426
Neurobasal 배지	써모 피셔	21103049
니콘 이클립스 Ti 마이코스코프	니콘
페니실린-스트렙토마이신(P/S) 용액	생물 산업	03-031-1
폴리-L-오르니틴(PLO)	시그마-알드리치	#P8638	1X PBS를 플리트레드로 1:1000 희석
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	다우코닝 코닝	#의 3097358-1004
Vannas 스프링 현미해부 가위, 3mm 블레이드	F.S.T	15000-00

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