쥐 요로 방광에서 일차 뉴런 및 신경교세포의 분리 및 배양

초록

출처: Wang, R. et al., 성체 쥐 방광에서 일차 뉴런 및 신경교세포의 격리 및 배양. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 쥐의 방광에서 뉴런과 신경교세포의 1차 배양을 생성하는 기술을 보여줍니다. 조직 준비, 단일 세포를 얻기 위한 효소 분해, 1차 신경 세포 및 신경교세포 배양을 확립하기 위해 뉴런 특이적 배지에서 세포를 배양하는 것과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 재료 준비

1. 실험을 수행하기 전에 오토클레이브를 사용하여 모든 기구와 ddH₂O를 멸균하십시오. 기구에는 수술용 가위, 안과용 가위, 집게, 숟가락, 핵 분배기, 유리 접시(직경 60–100mm) 및 유리 비커가 포함되지만 이에 국한되지 않습니다.
2. 크렙스 용액 준비(표 1): 사용하기 전에 모든 화학 물질을 ddH₂O로 용해시킵니다. CaCI₂ 를 별도로 용해시키고 침전물을 피하기 위해 저으면서 혼합 용액에 천천히 첨가합니다.
3. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 항생제/항진균제(100x)가 포함된 F12 배지로 구성된 헹굼 배지를 준비합니다. FBS 5mL와 항생제/항진균제 0.5mL를 F12 배지 44.5mL에 추가합니다.
4. 2% B-27, 1% FBS, 1% L-글루타민, 1% 항생제/항진균제(100x) 및 0.1% 신경교세포 유래 신경영양인자(GDNF)를 함유한 신경기저 A 배지로 구성된 뉴런 배지 A를 준비합니다. 9.5mL의 neurobasal A media.
   에 B-27 200μL, FBS 100μL, L-글루타민 100μL, 항생제/항진균제 100μL, GDNF 10μL(10μg/mL)를 추가합니다. 메모: B-27, L-글루타민 및 GDNF의 신선도를 보장하기 위해 사용 후 1주일 이내에 뉴런 배지 A를 준비합니다.
5. 뉴런 매체 A의 준비와 동일한 절차를 사용하여 FBS를 추가하지 않고 뉴런 매체 B를 준비합니다.
6. 산소가 안정된 크렙스 용액 10mL에 콜라겐분해효소 II형 20mg, 소 혈청 알부민 6mg, 항생제/항진균제(100x) 200μL를 용해하여 소화액 1을 준비합니다.
7. 0.25% 트립신 1mL를 Hank's balanced salt 용액 4mL로 희석하여 소화액 2를 준비합니다.
8. 코팅된 커버 슬립이 있는 접시를 준비합니다.
   1. 유리 커버 슬립을 48웰 배양 플레이트에 배치할 때 층류 벤치에서 집게를 사용합니다.
   2. poly-D-lysine을 ddH₂O로 0.1 mg/mL의 농도로 poly-D-lysine stock으로 희석합니다. 재고를 -20 °C에서 보관하고 그 전에 해동
   하십시오.
   3. 각 커버슬립 위에 40μL의 폴리-D-라이신 스톡을 추가하고 용액을 실온에서 10분 동안 배양합니다.
      메모: 기저 영역이 다른 다른 플레이트에 대해 농도를 4μg/^cm2로 조정합니다. 예를 들어, 24웰 플레이트에서 한 웰의 기저 면적이^2cm2인 경우 80μL의 폴리-D-라이신 스톡을 웰에 옮겨야 합니다. 각 cm² 에는 4 μg의 폴리 -D- 라이신이 포함되어 있습니다.
   4. 48웰 플레이트에서 폴리-D-라이신을 제거하고 ddH₂O로 커버슬립을 세 번 헹굽니다.
   5. 플레이트가 무수인지 확인하기 위해 층류 후드에서 플레이트를 최소 30분 동안 건조시킵니다.
   6. 플레이트를 라미닌 코팅 전에 최대 1일 동안 4°C에서 보관하십시오. 플레이트를 -20°C에서 보관하는 것이 장기 보관을 위해 바람직합니다.
   7. 4 °C에서 라미닌을 해동합니다. 라미닌을 ddH₂O로 50 μg / mL 농도로 라미닌 스톡으로 희석합니다. 육수를 -20°C에서 보관하고 사용하기 전에 4°C에서 해동하십시오.
   8. 피펫을 사용하여 100μL의 희석된 라미닌을 각 커버슬립 상단으로 옮기고 4°C에서 1시간 동안 라미닌을 배양
      메모: 기저 영역이 다른 다른 플레이트에 대해 농도를 5μg/^cm2로 조정합니다. 예를 들어, 24웰 플레이트에서 한 웰의 기저 면적이^2cm2인 경우 200μL의 희석된 라미닌을 웰로 옮깁니다. 각 cm² 에는 5 μg의 라미닌이 포함되어 있습니다.
   9. 라미닌 용액을 제거하고_ddH2O로 커버슬립을 한 번 헹굽니다. 긁히지 않도록 커버슬립의 가장자리에서 이 작업을 수행합니다.
      메모: 코팅된 커버슬립은 최대 2주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.

2. 방광 수확

1. 5주 된 Sprague–Dawley 쥐를 얻습니다.
2. 안정적인 산소 상태와 pH 수준에 도달하기 위해 얼음 수조에서 최소 30분 동안 Krebs 용액에 탄소(95% 산소, 5% CO₂)를 주입합니다.
3. 자궁 경부 탈구를 통한 안락사 후 쥐를 75% 에탄올에 30초 동안 담가 살균합니다.
4. 멸균된 수술용 수건 위에 쥐를 놓고 복부를 드러냅니다. 복강을 열고 가위와 집게로 방광을 드러냅니다.
5. 방광을 부드럽게 들어 올리고 교차 오염을 방지하기 위해 다른 가위와 집게로 방광 목에서 방광을 잘라냅니다. 세포 생존을 향상시키기 위해 차갑고 산소가 안정적인 크렙스 용액에 방광을 빠르게 넣습니다.
   메모: 방광이 제거되면 다음 작업을 빠르게 수행하여 뉴런 생존 가능성을 높입니다.
6. Krebs 용액을 세 개의 유리 접시와 유리 비커에 추가합니다.
7. 사전 냉각을 위해 얼음 욕조에서 Krebs 용액이 든 유리 접시와 비커를 준비합니다.
8. 혼동을 방지하기 위해 이러한 용기에 1-3 번호를 표시하십시오.
9. 각 유리 접시를 집게와 숟가락 핵 칸막이와 페어링합니다.
10. 유리 접시 1에서 안과 가위로 방광을 자르고 집게와 숟가락 핵 분배기로 펼칩니다.
11. 방광을 유리 비커 1로 헹구고 유리 접시 2에 넣습니다.
12. 유리 접시에 집게와 안과 가위를 사용하여 조직 표면의 부착 지방을 제거합니다 2.
13. 유리 비커 2에 방광을 헹구고 유리 접시 3에 넣습니다.
14. 집게와 숟가락 핵 분배기를 사용하여 방광을 유리 접시 3에 부드럽게 긁어 외인성 부착물을 제거합니다.
15. 유리 비커 3으로 방광을 헹구고, 방광을 14mL의 차가운 크렙스 용액이 담긴 15mL 원심분리 튜브로 옮긴 다음 356 x g 및 4°C에서 1분 동안 샘플을 회전시킵니다.
16. 오염을 줄이기 위해 Krebs 용액이 있는 두 개의 다른 튜브에서 이전 단계를 두 번 반복합니다.

3. 2단계 방광 소화

1. 원심분리 튜브에서 1mL의 소화 용액 1이 들어 있는 2mL 바이알로 블래더를 옮깁니다. 안과 가위를 사용하여 방광을 용액의 작은 조각(1mm 미만)으로 자릅니다.
2. 방광 용액과 9mL의 소화 용액 1을 멸균 세포 배양 접시(직경 100mm)에 혼합합니다. 진탕 인큐베이터에서 1% CO₂, 37°C 및 200rpm 미만에서 1시간 동안 분해를 수행합니다.
3. 1단계 분해 후 용액을 356 x g에서 4°C에서 8분 동안 원심분리합니다.
4. 예열을 위해 2°C 수조에 소화 용액 37을 놓습니다.
5. 원심분리 후 소화액 1이 포함된 상층액을 제거하고 세포 침전물을 수확합니다. 일부 남은 액체는 허용됩니다. 용액을 완전히 제거하면 세포 손실이 촉진될 수 있습니다.
6. 15mL 원심분리 튜브에 세포 침전물과 따뜻한 소화 용액 2를 혼합하고 혼합물을 흔들면서 37°C 수조에서 5분 동안 소화합니다. 2단계 소화 7분을 초과하지 마십시오. 그렇지 않으면 뉴런이 죽을 것입니다.
7. 분해 후 즉시 10mL의 차가운 헹굼 매체와 혼합물에서 트립신을 비활성화합니다.
   메모: 0 °C–4 °C에서 다음 단계를 수행합니다. 얼음 목욕은 그러한 조건을 제공할 수 있습니다.
8. 356 x g에서 4°C에서 8분 동안 원심분리 후 세포 침전물을 수확합니다. 남은 트립신은 세포 성장에 해를 끼치므로 가능한 한 많은 배지를 제거합니다.
9. 3mL의 뉴런 배지로 침전물을 부드럽게 재현탁합니다. 높은 생존율을 위해 세포가 포함된 용액에서 기포가 생성되지 않도록 하십시오.
10. 70μm 세포 여과기를 통해 혼합물 매체를 50mL 원심분리 튜브로 여과합니다.
11. 얼음 수조에서 30rpm으로 셰이커의 여과액을 30분 동안 유지합니다. 이 단계는 필수는 아니지만 권장됩니다.
12. 356 x g에서 4°C에서 8분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고 1mL의 뉴런 배지 A에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.
13. 준비된 48웰 플레이트의 각 웰에 500μL의 세포 혼합물을 추가합니다.
14. 37 ° C 및 5 % CO₂ 의 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
15. 1시간 내에 모든 배지를 뉴런 배지 B로 교체하여 무혈청 배양을 제공합니다.
16. 3일마다 뉴런 매체 B의 절반을 교체합니다.
    메모: 뉴런은 배양 5-7일 후에 면역세포화학 실험을 할 준비가 됩니다.

표 1. Krebs 용액 구성

명 표시기 분 호 년

재료	몰 농도 (mM)
나CI	120
증권 시세	5.9
나HCO3	25
Na2HPO4·12H2O	1.2
마그네슘2·6H2O	1.2
칼슘2	2.5
포도당	11.5

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신	지비코	15050065	효소 분해
48웰 배양 플레이트	코 닝	3548	코팅 접시
항생제/항진균제	지비코	15240062	배양 배지/린스 배지
나-27	지비코	17504044	문화 미디어
BSA 분수 V	지비코	332	효소 분해
CO2 인큐베이터	헤레우스	B16유우	세포 배양
콜라겐분해효소 II형	시그마	2593923	효소 분해
DMEM/F-12	지비코	11330032	헹굼 매체
소 태아 세럼	지비코	10100147	배양 배지/린스 배지
집게	상하이 Jin Zhong 의료 기기	1383	10cm; 멸균 작동
유리 비커	Huan Qiu 의료 기기	1101	50 밀리리터; 멸균 작동
유리 커버 슬립	WHB 사이언티픽	WHB-48-CS	코팅 접시
유리 접시	Huan Qiu 의료 기기	1177	100 밀리미터; 멸균 작동
층류 벤치	Su Jie 의료 기기	콜럼븀 1400V	멸균 작동
쥐 GDNF	페프로텍	AF45044	문화 미디어
Neurobasal-A 배지	지비코	10888022	문화 미디어
안과 가위	상하이 Jin Zhong 의료 기기	J21010	12.5cm; 멸균 작동
피 펫	에펜도르프	3120000240	100-1000 울; 시약 및 시료 피펫팅
피 펫	에펜도르프	3120000267	10-100 울; 시약 및 시료 피펫팅
폴리-D-라이신	시그마	P7280	코팅 접시
냉장 원심분리기	Ping 팬 악기	TGL-16ᅡ	효소 분해
쉐이킹 인큐베이터	Haimen Kylin-Bell 실험실 기기	T8-1	효소 분해
숟가락 핵 분배기	상하이 Jin Zhong 의료 기기	YZR030	12cm; 멸균 작동
수술용 가위	상하이 Jin Zhong 의료 기기	J21130	16cm; 멸균 작동
수술 수건	Fu Kang 의료 기기	5002	40 x 50cm; 멸균 작동
라미닌	시그마	엘2020	코팅 접시
L-글루타민	지비코	25030081	문화 미디어

년 의 년 년 년 (영문) 년