Plastic Microfluidic Chips를 사용한 분류된 1차 쥐 뉴런 배양

초록

출처: Nagendran, T., et al. 1차 쥐 뉴런을 구획화하기 위해 사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩을 사용합니다. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 1차 쥐 해마 뉴런의 구획화된 배양을 위해 사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩의 활용을 보여줍니다. 뉴런은 미세유체 구획 중 하나에 도금되어 부착되고 성장하여 칩의 미세 홈을 통해 축삭을 인접한 구획으로 확장합니다. 좁은 미세홈은 신경 세포체가 들어가는 것을 방지하여 체세포와 축삭 구획 사이의 물리적 분리를 가능하게 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 다중 구획 칩의 준비 및 코팅

1. 생물 안전 캐비닛에서 칩을 페트리 접시 또는 기타 적절한 멸균 용기에 넣습니다.
2. 칩의 왼쪽 상단 웰에 100μL의 사전 코팅 용액을 추가하고 메인 채널을 통해 인접한 웰로 흐르도록 합니다.
   메모: 사전 코팅 용액은 칩 내에 기포가 갇힐 가능성을 제거하기 위해 미세유체 채널을 사전 코팅하는 데 사용됩니다.
3. 왼쪽 하단 웰을 100μL의 사전 코팅 용액으로 채웁니다. 용액이 마이크로 홈을 통해 흐를 때까지 5분 동안 기다립니다.
4. 100μL의 사전 코팅 용액을 오른쪽 상단 웰에 추가하고 메인 채널을 통해 인접한 웰로 흐르도록 합니다. 오른쪽 하단 웰에 100μL의 사전 코팅 용액을 채웁니다.
5. 각 웰에서 용액을 흡입합니다. 주 채널에서 액체가 제거되지 않도록 주 채널에서 멀어지게 흡입합니다(그림 1A). 즉시 150μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 왼쪽 상단 웰에 추가합니다. 1.5분 대기
   주의: 동봉된 주 채널에서 모든 액체를 흡입하지 마십시오.
6. 왼쪽 하단 웰에 150μL PBS를 추가합니다. 액체가 마이크로 홈을 통해 흐를 수 있도록 5분 동안 기다립니다. 150μL PBS를 오른쪽 상단 웰에 추가합니다. 150μL PBS를 오른쪽 하단 웰에 추가합니다. 10분 기다립니다.
7. 두 번째 PBS 세척에 대해 1.5-1.6단계를 반복합니다.
8. 조직 배양 현미경 아래에서 칩에 주 채널에 기포가 있는지 확인합니다. 거품이 있는 경우 아래 절차를 수행합니다. 거품이 없으면 1.9단계로 건너뜁니다.
   1. 웰에서 PBS를 흡입하고 피펫 팁을 채널 개구부에서 각도를 맞춥니다(그림 1A).
   2. 100μL의 사전 코팅 용액을 상부 웰에 분배하고 피펫 끝을 채널 개구부 부근으로 각도를 맞춥니다(그림 1B). 거품은 채널을 통해 아래쪽 우물로 이동해야 합니다. 1.5분 기다립니다.
   3. 1.3-1.8단계를 반복합니다.
9. 웰에서 PBS를 흡입하고 피펫 팁을 채널 개구부에서 각도를 맞춥니다(그림 1A).
10. 100μL의 0.5mg/mL PDL(poly d-lysine)을 칩의 왼쪽 상단 웰에 추가합니다. 1.5분 기다립니다. 왼쪽 하단 웰을 100μL의 PDL로 채웁니다.
11. 100μL의 PDL을 칩의 오른쪽 상단 웰에 추가합니다. 1.5분 기다립니다. 오른쪽 하단 웰에 100μL를 추가합니다.
12. 페트리 접시를 닫고 칩을 37°C의 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.
13. PBS 세척 단계 1.5-1.6을 두 번 반복하여 과도한 PDL을 제거합니다.
14. 장치에서 PBS를 흡인합니다.
15. 즉시 100μL의 세포 배양 배지를 칩의 왼쪽 상단 웰에 추가합니다. 1.5분 기다립니다. 왼쪽 하단 웰에 미디어를 추가합니다. 오른쪽 상단 웰에 미디어를 추가합니다. 1.5분 기다립니다. 100μL 매체를 칩의 오른쪽 하단 웰에 추가합니다.
16. 세포를 플레이트할 준비가 될 때까지 칩을 37°C 인큐베이터에 넣습니다.

2. 다구획 칩에 뉴런 시딩

1. 확립된 프로토콜에 따라 해리된 쥐 해마 뉴런의 세포 현탁액을 준비하여 ~12 ×^{10 6} cells/mL.
   의 밀도를 생성합니다. 메모: 3 - 12 × 10⁶ cells/mL 사이의 세포 현탁 밀도를 사용할 수 있습니다. 더 낮은 밀도가 사용되는 경우, 칩에 추가되는 셀 현탁액의 부피가 증가할 수 있습니다. 아래에 설명된 절차는 쥐, 해리 피질 또는 해마 뉴런에 적용할 수 있습니다. 다른 뉴런 유형에 대한 최적의 세포 밀도는 다를 수 있습니다.
2. 칩의 각 웰에서 대부분의 매체를 제거하고 각 웰에 약 5μL를 남깁니다. 주 채널에서 액체가 제거되지 않도록 주 채널에서 멀어지게 흡입합니다(그림 1A).
   주의: 동봉된 주 채널에서 액체를 흡입하지 마십시오. 기포는 주 채널에서 유체를 흡입하면 칩에 갇힐 수 있습니다.
3. 오른쪽 상단 웰에 5μL의 세포 현탁액을 로드하고 오른쪽 하단 웰에 또 다른 5μL의 세포 현탁액을 로드합니다(총 ~120,000개 셀). 메인 채널 가까이에서 세포를 분배하여 세포를 로드합니다(그림 1B). 현미경으로 뉴런이 주 채널에 있는지 확인하십시오. 셀이 연결될 때까지 5분 동안 기다립니다.
   메모: 뉴런은 두 구획 중 하나에 로드할 수 있습니다. 설명을 위해 체세포 구획은 오른쪽의 주요 채널이지만 두 구획 중 하나를 체세포 구획으로 사용할 수 있습니다. 칩당 60,000개의 셀까지 더 낮은 셀 밀도를 사용할 수 있습니다. 최대 10μL의 세포 현탁액이 상기된 것보다 더 적은 세포를 갖는 세포 현탁액과 조합하여 체세포 구획의 각 웰에 첨가될 수 있다.
4. 약 150μL의 뉴런 배양 배지를 각각의 상부 및 하단 우측 웰에 추가한 다음 150μL의 배지를 각 상부 및 하단 우측에 추가합니다. 칩을 5% CO₂ 37 °C 인큐베이터의 가습 트레이에 넣습니다.
5. 24시간 후 웰에서 매체를 제거하여 매체 교체를 수행합니다. 메인 채널이 채워져 있는지 확인하십시오. 각 상단 웰에 150μL의 매체를 추가한 다음 하단 웰을 채웁니다.
6. 원하는 일수 동안 칩을 인큐베이터에 다시 넣습니다.
   메모: 며칠에 한 번씩 미디어를 모니터링하여 연한 분홍색으로 유지되는지 확인합니다. 미디어가 누렇게 변색이면 50%를 새 미디어로 교체하십시오. 유체 레벨이 낮으면 증발을 방지하기 위해 적절한 습도와 칩의 적절한 2차 봉쇄를 확인하십시오. 2차 격납 설비 및/또는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)-FEP 필름으로 칩이 들어 있는 접시를 덮어 매체 변화를 최소화하거나 제거할 수 있습니다.

결과

그림 1. 피펫팅 기술은 플라스틱 다구획 칩을 사용할 때 필요합니다. (A) 세척을 위해 매체를 추가하고 흡입할 때 그림과 같이 피펫 팁은 주 채널의 입구에서 각도를 맞춰야 합니다. (B) 뉴런을 로드하거나 축삭 절개술을 수행할 때 피펫 팁은 주 채널의 입구를 향해 각도를 유지해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자나칩	Xona 미세유체공학(LLC	XC150	150 μm 길이의 마이크로그루브 배리어
	Xona 미세유체공학(LLC	XC450	450 μm 길이의 마이크로그루브 배리어
	Xona 미세유체공학(LLC	XC900	900 μm 길이의 마이크로그루브 배리어
XC 프리코트	Xona 미세유체공학, LLC	XC 프리코트	XonaChips에 포함됨
소나PDL	Xona 미세유체공학, LLC	소나PDL
신경 세포 배양 배지
Neurobassal 배지	써모피셔 사이언티픽	21103049
B-27 플러스 보충제 (50개)	써모피셔 사이언티픽	A3582801
글루타맥스 보충제	써모피셔 사이언티픽	35050061
항생제-항진균제(100개)	써모피셔 사이언티픽	15240112
불소화 에틸렌 프로필렌 필름	미국 듀라필름	50암페어	0.5mil 두께
유리 파스퇴르 피펫	시그마-알드리치	CLS7095D5X 시그마	길이 5.75 인치
PBS(10배)	써모피셔 사이언티픽	QVC0508
인큐베이터, 5% CO2 37 °C