마우스 성상세포를 뉴런으로 직접 뉴런 재프로그래밍(Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes into Neurons)

초록

출처: Hersbach, B. A. et al., 마우스 성상세포의 분리 및 직접 신경 재프로그래밍. J. Vis. 특급 (2022)

이 비디오는 변형 인자를 뉴런으로 발현하는 성상세포의 직접 재프로그래밍을 보여줍니다. 형질전환 인자는 성상세포에서 뉴런으로의 전환을 촉진하는 일련의 분자 이벤트를 촉발합니다. 이 과정은 신경 분화 매체를 통해 특정 제제와 보충제를 공급함으로써 더욱 뒷받침됩니다.

프로토콜

1. 재프로그래밍을 위한 성상세포의 시딩

참고: 다음 단계는 안전 수준 1(SL1)의 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.

1. 이전에 배양 플라스크를 준비한 것과 동일한 방식으로 poly-D-lysine 코팅된 유리 커버슬립으로 24웰 플레이트를 준비합니다. 필요한 플레이트의 수를 결정하기 위해 성상세포가 24웰 플레이트에서 웰당 5-5.5 x 10⁴개의 세포의 밀도로 도말된다는 점을 고려하십시오. 일반적으로 출생 후 2일차(P2) 마우스에서 6개의 척수를 분리하면 약 1 x 10⁶개의 세포가 생성됩니다.
2. 배양된 성상세포를 함유한 T25 배양 플라스크에서 배지를 흡인하고 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 한 번 세척합니다. 0.5mL의 0.05% 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 첨가하여 배양 플라스크에서 성상세포를 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 플라스크 측면을 부드럽게 두드려 배양 플라스크 표면에서 세포를 분리하고 10X 배율을 사용하여 명시야 현미경으로 분리를 확인합니다.
3. 2.5mL의 성상세포 배양 배지로 트립신화를 중지하고 15mL 튜브에서 세포 현탁액을 수집합니다. 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 1mL의 성상세포 배양 배지에서 세포를 재현탁합니다. 혈구계(haemocytometer) 또는 자동 세포 계수 시스템을 사용하여 세포 농도를 계산합니다.
4. 세포 수에 따라 세포 현탁액을 새로운 성상세포 배지로 희석하여 mL당 1-1.1 x 105 세포의 용액을 얻습니다. 배지에 표피 성장 인자(EGF)와 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 인자당 10ng/mL로 보충합니다. 5-5.5 x 10⁴ 세포에 해당하는 500 μL의 세포 현탁액을 37 °C 및 5%_CO2에서 이전에 준비된 24-well 플레이트와 배양 세포의 각 웰에 추가합니다.

2. 전사 인자의 강제 표현

참고: 프로토콜을 진행하기 전에 실험을 적절하게 설계하는 것이 중요합니다. 특히, 재프로그래밍에 대한 음의 제어, 즉 재프로그래밍 요인이 표현되지 않는 조건을 항상 포함하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 리프로그래밍(reprogramming) 인자와 리포터(reporter)에 대해 cDNA를 운반하는 벡터를 사용하는 경우(예: 녹색 형광 단백질(GFP), DsRed), 음성 대조군은 리포터만 운반하는 동일한 벡터로 표시됩니다. 서로 다른 리포터를 동반하는 여러 요인을 표현할 때 그에 따라 네거티브 컨트롤을 조정해야 합니다.

1. 도금 다음 날, 24웰 플레이트를 검사하여 세포가 커버슬립에 부착되었는지 확인합니다.
2. 실험 목적과 가용 자원에 따라 바이러스 transduction(단계 2.3 참조) 또는 DNA transfection(단계 2.4 참조)을 통해 재프로그래밍 인자의 강제 발현을 달성할 수 있습니다.
   참고: 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 사용하려면 정부 당국의 승인이 필요하며 안전 수준 2(SL2)의 실험실 내 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.
3. 유전 정보를 운반하는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스로 세포를 형질주입하여 성상세포를 재프로그래밍하여 아래와 같이 관심 재프로그래밍 인자를 발현합니다.
   1
   1. μL의 세포 현탁액을 성상교세포 배지에 직접 첨가하여 1 x 10^10-1 x 10¹² particles/mL의 높은 바이러스 역가를 가진 세포를 형질도입합니다. 이것은 높은 감염률을 보장합니다. 바이러스 입자가 포함된 성상세포 배지로 세포를 37°C에서 24-36시간 동안 배양한 후 실험 목적에 따라 섹션 3을 진행합니다.
      참고: 다른 promoter를 사용하여 transgenes의 발현을 유도할 수 있습니다(대표 결과 참조). 구성적 프로모터{예: 거대세포바이러스(CMV), 치킨 β-액틴(CAG)}은 유도성 프로모터보다 먼저 전이유전자의 발현을 유도합니다. 그러나 두 가지 유형의 프로모터 유형 모두 세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
4. DNA 플라스미드는 또한 아래에 설명된 바와 같이 DNA transfection을 통해 성상세포에 도입될 수 있습니다.
   메모: 이는 SL1에 대해 승인된 생물 안전 캐비닛에서 수행할 수 있습니다.
   1. transfection 전에, transfection 시약, 원하는 작제물의 플라스미드 DNA, 새로운 성상세포 배지 및 혈청 환원 배지를 수득한다(Table of Materials(재료표 참조). 24웰 플레이트의 각 웰에 300μL의 혈청 환원 배지가 필요하다는 점을 고려하여 필요한 혈청 환원 배지의 양을 계산합니다(재료 표 참조). 50mL 튜브에 적당량의 혈청 환원 배지를 넣고 37°C로 예열합니다.
   2. 혈청 환원 배지가 따뜻해지면 모든 웰에서 성상세포 배지를 흡인하고 50mL 튜브에 수집합니다. 수집된 성상세포 배지를 0.45μM 주사기 필터로 필터링하여 분리된 세포를 제거합니다.
   3. 여과된 배지에 동일한 부피의 새로운 성상세포 배지를 추가하여 웰당 1mL의 성상세포 배지를 추가하기에 충분한 용액을 얻습니다. 사용할 때까지 인큐베이터에서 성상세포 조건화된 배지를 37°C로 유지합니다(단계 2.4.9).
      메모: 배양 배지는 배양의 생존 가능성을 지원하는 몇 가지 분비 인자를 포함하고 있기 때문에 재사용됩니다.
   4. 각 웰에 300μL의 예열된 혈청 환원 배지를 추가하고 24웰 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다.
   5. DNA와 혈청 환원 배지로 구성된 용액 A를 준비합니다. 각 웰에 대해 총 0.6μg의 DNA를 사용하고 이를 50μL의 혈청 환원 배지에 추가합니다. 용액 A를 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오.
      참고: 일반적으로 조건별 기술적 삼중이 고려됩니다. 그러므로, 24-웰 플레이트의 3 웰을 형질주입하기에 충분한 물질을 확보하기 위해, 3.5 반응에 충분한 혼합물(예: 175 μL의 혈청 환원 배지에 희석된 총 DNA 2.1 μg)을 준비한다.
   6. transfection 시약과 혈청 환원 배지로 구성된 용액 B를 준비합니다. 각 웰에 대해 0.75μL의 트랜스펙션 시약을 50μL의 혈청 환원 배지에 추가합니다. 이 용액은 모든 transfection 조건에 공통적이므로 transfection 간의 변동성을 줄이기 위해 대량으로 준비하십시오.
   7. 용액 B를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 용액 B를 용액 A에 1:1 비율로 한 방울씩 넣고 부드럽게 섞습니다. 소용돌이치지 마십시오. 용액 A+B를 후드 아래 실온에서 20-30분 동안 배양합니다.
   8. 모든 transfection 조건에 대해 2.4.5-2.4.7 단계를 반복합니다. 20-30분 후 용액 A+B를 각 웰에 한 방울씩 추가하여 최종 부피 100μL를 만듭니다. 플레이트를 부드럽게 흔들고 세포를 37°C의 인큐베이터에 4시간 동안 다시 넣습니다.
   9. 4시간 후, 형질주입 배지를 제거하고 2.4.3단계에서 제조된 예열된 성상세포 조건화된 배지 1mL를 추가합니다. 실험의 목적에 따라 섹션 3을 진행하기 전에 36-48시간 동안 세포를 유지하십시오.

3. 성상세포의 재프로그래밍(7일 분석)

1. 염기성 배양 배지 49mL에 B27-supplement 1mL를 첨가하여 신경 세포 분화 배지를 준비합니다. 24-48시간 후, 세포의 transduction 또는 transfection의 여부에 따라(각각 2.3 및 2.4단계 참조), 성상세포 배지를 웰당 1mL의 신경 분화 배지로 교체하고 37°C 및 9% CO₂.
   에서 세포를 배양합니다. 알림: 9% CO₂ 인큐베이터를 사용할 수 없는 경우 셀을 5% CO₂로 유지할 수도 있습니다. 그러나 신경 세포 재프로그래밍은 이러한 조건에서 더 효율적입니다.
2. 선택 사항: 재프로그래밍 효율을 높이기 위해 성상세포 배지를 분화 배지로 교체할 때 Forskolin(최종 농도 30μM) 및 Dorsomorphin(최종 농도 1μM)으로 신경 분화 배지를 보충합니다. 포스콜린과 도르소모르핀으로 세포를 치료하기로 선택할 때, 초기 치료 2일 뒤에 도르소모르핀의 두 번째 용량을 제공하십시오. 이 두 번째 처리를 배양 배지에 직접 첨가합니다.
3. 쥐 성상세포를 신경 세포로 직접 재프로그래밍하는 것은 일반적으로 배지를 변경한 후 7일 이내에 발생합니다(그림 1). 따라서 신경 세포 재프로그래밍이 시작된 후 7일이 지나면 다운스트림 분석을 위해 세포를 고정하거나 수집합니다.

결과

그림 1 : 성상세포 배양 및 재프로그래밍에 대한 개요. (가)성상세포에서 뉴런으로의 직접 변환의 타임라인. 각 검은색 선은 프로토콜의 중요한 단계를 나타냅니다. (B) 배양 7일 후 배양된 척수 유래 성상세포의 대표적인 명시야 이미지. 사진은 명시야 현미경과 10x 대물렌즈를 사용하여 촬영했습니다. 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. (C) 24웰 플레이트에서 웰당 5.5 x 104 세포의 밀도로 재도금한 후 1일 후의 척수 성상세포의 대표적인 명시야 이미지. 이미지는 명시야 현미경과 10x 대물렌즈를 사용하여 촬영했습니다. 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. (D) 배양 순도를 입증하기 위해 도금 1일 후에 고정된 성상세포에 대한 βIII-tub, Sox9, GFAP 삼중 염색의 면역형광 이미지. 세포를 4% 파...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신/EDTA	생명 기술	25300054
B27 보충제	생명 기술	17504044
bFGF	생명 기술	13256029
DMEM/F12	생명 기술	21331020
도르소모르핀	시그마 알드리치	P5499
증권 시세	생명 기술	PHG0311
소 태아 세럼	PAN 생명공학	P30-3302
포스콜린	시그마 알드리치	F6886
Lipofectamine 2000 (트랜스펙션 시약)	써모 피셔	고양이# 11668019
OptiMEM – GlutaMAX (혈청 감소 배지)	써모 피셔	카탈로그 # 51985-026
페니실린/스트렙토마이신	생명 기술	15140122
폴리-D-라이신	시그마 알드리치	P1149

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