청각 뉴런을 시각화하기 위한 쐐기 뇌 슬라이스 준비하기

초록

출처: Fischl, M. J. et al., 생체 내 신경 회로 연결을 모방하기 위한 시험관 내 쐐기 슬라이스 준비.J. Vis. 특급(2020년)

이 비디오는 실험실 환경에서 쐐기 모양의 뇌 절편을 준비하는 과정을 보여줍니다. 비브라톰을 사용하여 쥐의 뇌에서 나온 쐐기 모양의 조각을 다양한 두께로 만듭니다. 이 절편에는 청각 신경근이 두꺼운 쪽에 위치하고, 청각 관련 뉴런은 얇은 쪽에 위치합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 자극을 위한 온전한 청각 신경근으로 뇌 제거

참고: 이 실험을 위한 마우스는 C57BL/6J 배경의 ChAT-IRES-Cre 형질전환 마우스와 tdTomato 리포터 마우스(Ai14)를 교배하여 얻었습니다. 조직학 및 전기생리학에 사용된 마우스는 청각 후 발병(P14-P23)이었으며, 이는 마우스에서 약 P12입니다. 사다리꼴체(VNTB)의 복부 핵에서 tdtomato를 발현하는 뉴런은 이전에 이 마우스 라인에서 내측 올리보코클리어(MOC) 뉴런으로 특성화되었습니다.

1. 승인된 제도적 절차에 따라 동물을 안락사(예: CO₂ 질식)하고 참수합니다.
2. 면도날을 사용하여 코에서 목 뒤쪽까지 두개골 정중선의 피부를 자릅니다. 두개골이 드러나도록 피부를 벗겨냅니다.
3. 작은 가위를 사용하여 두개골의 기저부(척수 근처의 꼬리 끝)에서 시작하여 코를 향해 계속하여 정중선을 통해 두개골을 절개합니다.
4. 람다 봉합사에서 정중선에서 양쪽 귀를 향해 측면으로 두개골을 절개합니다. 두개골을 벗겨 뇌를 드러냅니다.
5. 로스트랄 끝에서 시작하여 작은 실험실 주걱이나 뭉툭한 집게로 두개골에서 뇌를 부드럽게 들어 올립니다. 시신경을 절단하고 뇌를 부드럽게 뒤로 움직여 복부 표면을 노출시킵니다.
6. 뇌간의 복부 표면 근처에서 미세한 집게로 삼차 신경을 꼬집어 절단합니다.
   메모: 전정 신경이 이 바로 아래에 있고 궁극적인 자극을 위해 손상되지 않아야 하므로 이 작업을 조심스럽게 수행하십시오.
7. 차가운 슬라이스 용액으로 채워진 유리 페트리 접시에 준비물을 놓습니다. 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 발암원으로 부드럽게 거품을 냅니다.
8. 뇌간에 가까운 안면 신경을 자르고 전정 신경을 노출시킵니다.
9. 가는 집게를 사용하여 전정 신경이 두개골에서 나오는 유공(foramina)으로 끝을 밀어 넣고 신경을 꼬집어 절단하여 신경근이 뇌간에 부착된 상태로 둡니다. 반대쪽에서도 이것을 반복하십시오.
10. 양쪽 신경근이 자유로워지면 사다리꼴체 근처 뇌간의 복부 표면에서 수막과 혈관 구조를 제거합니다.
11. 남아 있는 뇌신경과 결합 조직을 꼬집어 두개골에서 뇌를 완전히 분리하고, 가능한 한 남아 있는 척수를 보존하도록 주의를 기울인다.

2. 무대에 뇌 차단 및 장착(자기 디스크)

1. 시신경 수준에서 뇌를 차단하여 뇌 표면에 고정할 수 있도록 뇌 표면을 준비합니다.
   1. 복부 표면이 위로 향하게 한 상태에서 무딘 도구를 사용하여 척수를 부드럽게 고정시켜 다음 단계에서 뇌가 기울어지지 않도록
   뇌를 안정화합니다.
   2. 시신경 수준에서, 열린 집게를 사용하여 뇌를 통해 접시 바닥까지 삽입하여 뇌를 차단하는 평면을 만듭니다. 집게를 수직에서 약 20° 각도로 삽입하여 끝이 뇌의 등쪽 표면에서 꼬리를 벗어나 시신경으로 가
   도록 합니다.
   3. 면도날을 사용하여 집게를 따라 자릅니다.
2. 뇌를 무대 표면에 붙입니다.
   1. 뇌를 지원하기 위해 4% 한천의 작은 블록(~1cm³)을 준비합니다.
   2. 무대에 작은 접착제 한 방울을 놓고 직사각형으로 펴서 뇌와 한천 블록이 모두 접착될 수 있도록 합니다.
   3. 집게를 사용하여 뇌를 조심스럽게 들어 올리고 종이 타월 가장자리를 사용하여 여분의 액체를 부드럽게 두드립니다. 막힌 표면을 접착제 위에 놓으면 자르는 동안 복부 표면이 칼날을 향하게 됩니다.
   4. 한천 블록을 뇌의 등쪽 표면에 부드럽게 밀어 자르는 동안 지지하고 적절한 뇌 위치(즉, 각도)를 보장합니다.

3. 쐐기 슬라이스를 만들기 위해 브레인을 슬라이스합니다.

참고: 두꺼운 쪽에는 달팽이관 신경근이 있고 얇은 쪽에는 내측 올리보코클리어(MOC) 뉴런과 사다리꼴체의 내측핵(MNTB)이 있는 비브라톰을 사용하여 뇌 절편을 준비합니다.

1. 뇌가 부착된 자기 디스크를 스테이지 베이스에 놓고 뇌의 복부 표면이 블레이드를 향하도록 슬라이싱 챔버에 놓습니다.
2. 챔버를 얼음처럼 차가운 슬라이스 용액으로 채우고 발탄제로 거품을 일으킵니다.
3. 블레이드를 용액 속으로 내리고 관심 영역까지 꼬리 쪽으로 슬라이스를 잘라 슬라이스가 대칭이 되도록 합니다. 슬라이스가 비대칭으로 보이면 스테이지를 약간 기울여 대칭을 얻습니다.
   메모: 0.05-0.10mm/s 사이의 블레이드 속도는 건강한 조각을 자르는 데 효과적이었으며 동물의 나이와 뇌 영역에 따라 다를 수 있습니다.
4. 슬라이스가 대칭이 되면 스테이지를 한쪽으로 ~15°(스테이지 베이스의 약 3개의 동심원에 해당)로 이동합니다.
   메모: 슬라이스에서 보존하려는 청각 신경근에서 스테이지를 멀리 이동합니다.
5. 청신경근이 한쪽 표면에 가까워지고 안면 신경이 다른 쪽 표면에서 보일 때까지 조심스럽게 계속 자릅니다.
6. 스테이지를 원래 위치로 15° 뒤로 이동합니다.
7. 칼날을 조직에서 멀리 옮기고 s를 회전합니다.tage 베이스를 90° 회전하여 얇은 면의 측면 가장자리가 칼날을 향하도록 합니다. 칼날을 수백 미크론 낮춘 다음 천천히 칼날을 조직 가장자리에 가깝게 가져옵니다. 블레이드가 측면 가장자리에 닿을 때까지 이 작업을 반복합니다. 슬라이스의 얇은 가장자리의 원하는 두께로 블레이드를 낮추고 여기에 추가로 200미크론을 내립니다.
   메모: 결과 슬라이스는 패치 클램핑이 발생하는 쪽의 사다리꼴체(VNTB)의 복부 핵 수준에서 이상적으로 ~300mm 두께입니다.
8. 블레이드를 조직에서 멀리 옮기고 스테이지 베이스를 다시 돌려 복부 표면이 이를 향
하도록 합니다.
9. 쐐기 슬라이스의 로스트랄 표면을 지정하는 절단을 만듭니다. 슬라이스를 인터페이스 용지 조각(1cm²) 꼬리 표면 아래로 옮깁니다. 회수를 위해 슬라이스를 배양 챔버 또는 기타 적절한 배양 장치로 이동합니다(35°C에서 30분).
   메모: 안면 신경은 상부 표면에 있는 절편의 양쪽 반구에서 볼 수 있어야 합니다(그림 1B 참조).

결과

그림 1: 쐐기 슬라이스 개략도 및 예시 이미지.(A) 내측 올리보코클리어 피드백 회로의 개략도. 파란색 화살표는 MOC 뉴런으로 향하는 구심성 상승 경로를 나타내고, 검은색 화살표는 MOC 뉴런에서 바깥쪽 유모 세포(OHC)의 기저부까지 하강하는 피드백 경로를 나타냅니다. (B) 두꺼운 면에 청신경근(ANR)과 달팽이관 핵(점선 윤곽선)의 레이블이 있는 쐐기 절편의 명시야 이미지. 별표는 사다리꼴 몸체의 복부 핵의 대략적인 위치를 나타내며, 여기서 MOC 뉴런은 쐐기 슬라이스의 얇은 쪽에서 패치 클램핑을 목표로 합니다. 검은색 점선은 안면 신경을 나타내며, 이는 상부 표면에 있는 절편의 양쪽 반구에서 볼 수 있습니다. IHC - 내부 유모 세포, GBC - ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
실험적 제제
한천, 가루	피셔 사이언티픽	BP1423500	4% 한천 블록은 진동 절편 중 뇌 조직을 안정화하는 데 사용됩니다.
AlexaFluor 하이드라지드 488	인비트로젠	A10436	성공적인 MOC 뉴런 패치를 확인하기 위해 내부 용액에 사용되는 형광단
분석 저울	Geneses Scientific (인트라몰)	AV114	화학물질 계량
양날 면도날	테드 펠라	121-6	진동 절단 칼날
키누렌산(5g)	시그마 알드리치	K3375-5G	슬라이싱: ACSF 첨가제: 패치 클램핑을 위한 조직 건강을 개선하기 위해 해부 및 슬라이싱 중 뉴런 활동을 줄이는 데 사용됩니다.
pH 측정기	피셔 사이언티픽(인트라몰)	제13-620-451	용액 pH 테스터
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해부와 슬라이싱
바이오사이틴	시그마 알드리치	B4261-250MG	축삭 추적에 사용되는 화학 물질(Streptavidin 488에 접합)
해부 현미경	암스코프	SM-10억	뇌 제거 중 정밀 해부
Dumont #5 집게	정밀 과학 도구	11252-20	미세 집게 해부 도구
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슈퍼 글루	뉴에그	15187	vibratome stage에 조직을 접착하는 데 사용됩니다
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