금 나노로드를 이용한 신경 세포 분화 자극

초록

출처: Paviolo., et al. 신경 세포의 금 나노막대 보조 광학 자극. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 신경 세포를 βIII-튜불린에 의해 지지되는 세포 돌기를 형성하는 금 나노막대와 레이저 광에 노출시켜 신경 세포 분화를 촉진하는 기술을 보여줍니다. epifluorescence 현미경 검사법으로 tubulin과 세포핵을 염색하고 관찰하면 세포 성장이 나타나 신경 세포 분화에 대한 나노 막대의 효능을 나타냅니다.

프로토콜

1. NG108-15 신경 세포주 배양 및 분화

1. 세포 배양 배지의 경우, 10%(w/v) 태아 송아지 혈청(FCS), 1%(w/v) L-글루타민, 1%(w/v) 페니실린/스트렙토마이신 및 0.5%(w/v) 암포테리신 B.
   를 포함하는 멸균 Dulbecco의 변형된 이글 배지(DMEM) 500ml를 준비합니다. 참고: 보충제는 분주하여 -20°C에서 보관하고 필요한 날에 배지에 추가할 수 있습니다. 세포 배양 배지는 최대 1개월 동안 멸균 상태로 냉장 보관할 수 있습니다.
2. 세포 분화 배지의 경우, 1%(w/v) L-글루타민, 1%(w/v) 페니실린/스트렙토마이신, 0.5%(w/v) 암포테리신 B를 함유한 멸균 DMEM 50ml를 준비합니다.
3. 가습된 분위기(37°C에서 5% CO2)의 인큐베이터에서 폴리스티렌으로 만든 T75 플라스크의 세포 배양 배지 10ml에서 NG108-15 신경 세포를 성장시킵니다. 일반적으로 각 플라스크에 1.5-2 × 10⁵ 개의 세포를 파종하여 3-4 일 안에 준비하십시오. 이틀에 한 번씩 세포 배양 배지를 교체하십시오.
   참고: 유전적 부동이나 변이를 방지하려면 통로 21보다 오래된 세포를 실험에 사용하지 마십시오.
4. 배양에 70-80%가 합류하면 배지를 따뜻한 신선한 세포 배양 배지로 변경합니다. 융합 플라스크의 바닥을 부드럽게 두드려 세포를 기계적으로 분리합니다. 트립신을 사용하지 마십시오.
5. 세포 현탁액을 600 x g에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 2ml의 따뜻한 세포 분화 배지에 다시 현탁시킵니다.
6. 200 μl의 세포 분화 배지를 갖는 조직 배양 폴리스티렌 96 웰 플레이트에 시드 2 ×^{10 4} cells/cm². 5% CO2 / 37 °C에서 1일 동안 실험을 배양합니다.
7. 2일차에 3.2 × 10⁹ - 4.2 ×^{10 10} particles/ml의 금 나노로드(Au NR) 용액을 추가하고 추가로 24시간 동안 배양합니다. 대조 실험에 파티클을 추가하지 마십시오.
   참고: 대체 대조군으로, 피크 흡수 파장이 잘 분화된 금 나노 입자(Au NP)를 비교 목적으로 사용할 수 있으며, 보다 일관된 세포 거동을 위해 세포 밀도를 일정하게 유지하고 세포 파종 전에 웰 표면을 변형하지 마십시오.

2. 뉴라이트 성장 강화

1. 레이저를 단일 모드 광섬유(개구수 = 0.13)와 연결하고 광섬유 커넥터로 종단합니다(FC 커넥터는 편리하고 일반적으로 사용 가능). 표준 파워 미터로 출력 레이저 출력을 측정합니다. 가장 효과적인 결과를 얻으려면 레이저의 피크 파장을 NR의 플라즈몬 공명 피크와 일치시키십시오.
2. NR 배양 후 3일차에 FC 커넥터를 웰에 고정합니다. 다양한 레이저 출력에 대해 연속파로 1분 동안 RT에서 샘플과 대조군을 조사합니다. 5% CO2 / 37 °C에서 추가로 3일 동안 배양을 진행합니다. 최소 3회의 독립적인 측정을 위해 레이저 조사를 반복합니다.
   참고: 응용 프로그램에 따라 다른 조사 시간과 펄스 주파수를 선택할 수 있습니다.
3. 빔 직경과 레이저 방사 조도(W∙cm-2)로 레이저를 특성화합니다.
   1. 표준 단일 모드 광섬유의 경우 NA = n∙sinθ를 사용하며, 여기서 n은 사용 중인 매체의 굴절률이고 θ는 광섬유에서 나오는 원뿔의 반각입니다(그림 1A 참조). 삼각법에서 r = tanθ∙d, 여기서 r은 빔 반경이고 d는 광섬유와 샘플 사이의 거리입니다. FC 커넥터는 우물의 직경과 일치하므로 거리 d = 2.70 ± 0.20mm에서 샘플을 비춥니다. 빛은 물에서 섬유를 빠져 나가며(n = 1.33) r = tan(sin-1(NA/n))∙d를 제공합니다.
   2. 후자의 방정식을 사용하여 타겟에서 레이저 빔 반경, 해당 빔 면적 및 평균 레이저 방사 조도(레이저 출력을 빔 영역으로 나눈 값)를 계산합니다(그림 1B의 예시 그래프 참조). 이 값은 조명이 켜진 영역에 대한 평균 방사 조도를 나타냅니다.
   3. 일반 오류 전파 이론을 사용하여 측정에 대한 오류를 평가합니다.
      참고: FC 커넥터와 샘플 사이의 거리는 적절한 소프트웨어(예: ImageJ)를 사용하여 이미지의 실험 배열 및 후처리 사진으로 측정할 수 있습니다.
4. 5일차에 실험에서 세포 분화 배지를 제거하고 3.7%(v/v) 포름알데히드 용액으로 샘플을 10분 동안 고정한 다음 0.1%(v/v) Triton X-100으로 20분 동안 세포를 투과시킵니다.
5. 샘플에 3%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 60분 동안 첨가하여 미반응 단백질 결합 부위를 차단합니다. 4°C에서 하룻밤 동안(BSA 1%가 보충된 PBS의 5μg/ml) 항-βIII-튜불린 샘플에 라벨을 부착합니다.
6. PBS의 1% BSA 중 0.4-2 μg/ml의 농도를 사용하여 적절한 2차 항체(예: TRITC(Tetramethylrhodamine)-conjugated anti-mouse IgG 항체)로 어두운 곳에서 90분 동안 세포를 배양합니다. 세포핵에 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌)(탈이온수 중 0.1μg/ml)를 10분 동안 라벨링합니다.
   참고: 항체 접합 및 농도는 회사 프로토콜에 따라 달라질 수 있습니다. 각 염색 단계 후 5분 동안 PBS로 샘플을 두 번 세척합니다.
7. 최소 20× 대물렌즈를 사용한 epifluorescence 또는 confocal microscopy로 인한 이미지 샘플. 2차 항체에 따라 현미경 필터를 선택합니다. DAPI 필터(λEX = 358nm, λEM = 488nm)를 선택하여 세포핵을 시각화합니다.
8. i) 최대 신경돌기 길이(신경돌기 끝에서 세포체 시작 부분까지의 길이 기록), ii) 신경세포 당 신경돌기 수(세포당 모든 신경돌기 합산) 및 iii) 신경돌기가 있는 세포의 비율(βIII-튜불린을 발현하는 총 세포 수를 양성으로 염색된 핵을 가진 총 세포 수로 나눜)을 평가하여 사진을 분석합니다.

결과

그림 1. 광섬유 실험 설정(A) 및 면적의 레이저 빔에 대한 레이저 출력의 함수로서의 평균 레이저 방사 조도는 0.4mm2(B)와 같습니다. 빔 매개변수는 (A): 광섬유에서 나오는 최대 광 원뿔의 반각(θ), 빔 반경(r) 및 광섬유와 샘플 사이의 거리(d)입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Au NR	시그마 알드리치	716812
NG108-15	시그마 알드리치	8811230
DMEM을 참조하십시오.	시그마 알드리치	D6546
증권 시세	생명 기술	10100147
L-글루타민	시그마 알드리치	G7513
페니실린/스트렙토마이신	생명 기술	15140122
암포테리신 B	생명 기술	15290018
포름알데히드	시그마 알드리치	F8775
트리톤 X-100	증권 시세 표시기	T8532
증권 시세	시그마 알드리치	A2058 (영어
항 βIII- 튜불린	프로메가	G7121
TRITC-conjugated anti-mouse IgG 항체	시그마 알드리치	T5393
다피	인비트로젠	D1306 (영어
UV-Vis 분광계	바리안 메디컬 시스템즈	캐리 50 바이오
소형 분리기	에펜도르프	미니 스핀
음파 목욕탕	Unisonics 오스트레일리아	FPX 10D
세포 배양 인큐베이터	켄드로	헤라 셀 150
세포 배양 원심분리기	헤티치	로토픽스 32A
레이저 다이오드	옵토텍	780nm 단일 모드 광섬유 - 결합 LD
광섬유	쏘랩스	780의 체력
파워 미터	간섭성의	레이저 체크
이미지J	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
에피 형광 현미경	축삭 기기	이미지X-프레스 5000A
PBS (PBS)
폴리스티렌 96 웰 플레이트
이산화탄소(CO2
T75 플라스크