제브라피시 배아(zebrafish embryos)에서 일차 망막 신경절 세포 배양 생성

초록

출처: Terzi, A., et al., ROS 신경 발달 중 라이브 셀 이미징. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 제브라피시 배아에서 일차 망막 신경절 세포를 배양하는 방법을 보여줍니다. 초기 단계의 배아는 눈을 분리하기 위해 해부를 거치고, 그 후 기계적으로 해리되어 망막 신경절 세포의 현탁액으로 만들어집니다. 이 세포 현탁액은 축삭돌기 발달을 촉진하기 위해 접착 단백질로 코팅된 커버슬립에서 배양됩니다.

프로토콜

1. 솔루션 준비

1. E2 미디어(1개)
   1. 표 1에 표시된 모든 성분을 결합하여 100x E2A(500mL), 500x E2B(100mL) 및 500x E2C(100mL) 용액을 준비합니다. 오토클레이브 E2A, E2B 및 E2C 솔루션. 4 °C에서 보관하십시오.
   2. E2 매체 1개: 100x E2A 5mL, 500x E2B 1mL 및 500x E2C 1mL를 결합합니다. 멸균수와 함께 부피를 500mL로 가져옵니다. pH를 7.0-7.5로 조정합니다.
   3. 1x E2 배지 50mL 분취액을 준비하고 장기 보관을 위해 -20°C에서 보관합니다. 그러나 해동 시 강수량이 발생할 수 있습니다. 원액을 사용하기 전에 강수량이 완전히 용해되었는지 확인하십시오.

표 1: 제브라피시 세포 배양을 위한 1x E2 배지의 구성 요소.

용액	구성 요소	분량	농도
100X E2A (500mL)
	염화나트륨	43.8 지	1500 밀리미터미터
	케이클	1.88 지	50 밀리미터.
	재질 보기 MgSO4	6 지	100 밀리미터미터
	KH2사서함4	1.03 지	15 밀리미터미터
	나2HPO4	0.34 지	5 밀리미터미터
500X E2B(100mL)
	염화칼슘2	5.5 지	500 밀리미터미터
500X E2C(100mL)
	나HCO3	3 지	350 밀리미터미터
E2 1개(500mL)
	100X E2A	5 밀리리터	1배
	500X E2B	1 mL	1배
	500X E2C	1 mL	1배

1. E3 미디어(1x)
   1. 표 2와 같이 1L 멸균수에 구성 요소를 용해시켜 100배 스톡을 만듭니다. 스톡을 멸균수에 희석하여 1x E3 매체를 만듭니다.
   2. 0.2% 메틸렌 블루를 추가합니다. 1x E3 배지 20mL에 메틸렌 블루 40μL를 추가합니다.

표 2: 제브라피시 배아 유지를 위한 100x E3 미디어의 구성 요소.

초 명 호 의 분 분 호 분

구성 요소	금액 (g)	100X 재고의 농도(mM)
염화나트륨	29.22	500
케이클	1.26	17
염화핵2 2H2O	4.85	33
마그네슘4 7H2O	8.13	33

1. 80x 식염수 원액
   1. 표 3에 표시된 모든 구성 요소를 결합합니다. 물을 넣어 100mL 용액을 만듭니다. 모든 성분이 용해될 때까지 혼합합니다. 용액을 4°C에서 보관하십시오.

표 3: 제브라피시 세포 배양 배지용 80x 식염수 용액의 구성 요소.

호 의 호 의 분 명

구성 요소	금액 (g)	재고 농도 (mM)
포도당	1.44	80
나트륨 피루브산	0.44	40
염화핵2 2H2O	0.148	10
헤페스	6.1	256

1. 제브라피시 세포 배양 배지(ZFCM+)
   1. 표 4에 표시된 모든 성분을 결합하여 250mL 배지를 만듭니다. pH를 7.5로 조정합니다. 0.22μm 필터를 사용하여 여과 매체를 만들고 4°C에서 보관합니다.

표 4: 혈청 및 항생제가 함유된 제브라피시 세포 배양 배지의 구성 요소.

분 개 개 개 년 호 년 일

구성 요소	양(mL)	부피 %
L-15 미디엄 (페놀 레드 포함)	212.75	85.1
소 태아 세럼(FBS)	5	2
페니실린/스트렙토마이신	1	0.4
80X 식염수	3.125	1.25
물	28.125	11월 25

2. 제브라피쉬 배아에서 유래한 1차 망막 신경절 세포 배양

참고: 층류 후드에서 2.1 및 2.2 단계를 수행합니다.

1. 커버 슬립의 준비
   1. 각 실험에서 4-6개의 배양 플레이트를 준비합니다. 22% 에탄올에 보관된 산성 세척 커버슬립(22 x 22mm 정사각형, 0.16-0.19mm 두께)을 사용하십시오.
   2. 집게를 사용하여 보관 용기에서 커버슬립 하나를 제거하고 불을 붙여 잔류 에탄올을 제거합니다.
   3. 커버슬립을 35mm 배양 접시 안에 비스듬히 넣어 완전히 자연 건조시킵니다.
   4. 10x 스톡(5mg/mL)을 멸균수에 희석하여 Poly-D-Lysine(PDL) 작업 용액(1x)을 준비합니다.
   5. 각 커버슬립의 중앙에 100μL의 0.5mg/mL PDL을 바르고 용액이 가장자리로 퍼지지 않도록 합니다.
   6. PDL을 실온(RT)에서 20-30분 동안 커버슬립에 배양합니다. PDL이 마르지 않는지 확인하십시오.
   7. PDL을 0.5mL 멸균수로 세 번 세척합니다. 접시를 완전히 말리십시오.
   8. 1x PBS에 50x 스톡(1mg/mL)을 희석하여 라미닌 작업 용액(1x)을 준비합니다.
   9. PBS에 있는 20 μg/mL laminin 100 μL를 각 커버슬립의 중앙에 도포하고 용액이 가장자리로 퍼지는 것을 방지합니다.
   10. 37°C의 가습 인큐베이터에서 2-6시간 동안 플레이트를 배양합니다. 라미닌 용액의 건조를 피하십시오.
2. 배아 해부 및 도금 RGC
   1. 35mm 조직 배양 접시 4개를 준비하고 라벨을 붙이고 해부 당일 70% 에탄올, "E2 배지 2", "E2 배지 3" 4mL를 채웁니다. 접시가 분해될 때까지 냉장고에 보관하십시오.
   2. 제브라피시 배아가 수정 후 34시간(hpf)이 되면 라미닌으로 코팅된 배양 접시를 인큐베이터에서 꺼내 0.5mL의 1x PBS로 커버슬립을 3회 세척합니다.
   3. 최종 세척 후 각 배양 접시에 4mL의 ZFCM(+) 배지를 추가하고 플레이트가 건조되지 않도록 합니다.
   4. 2.2.1단계에서 준비된 배양 요리를 검색합니다. 그것들이 RT와 평형을 이루게 하라.
   5. 4-6개의 PCR 튜브를 15μL의 ZFCM(+) 배지로 채웁니다. 4개의 눈에서 나온 망막 신경절 세포를 하나의 커버슬립에 도금하기 위해 하나의 튜브가 필요합니다.
   6. 인큐베이터에서 제브라피시 배아를 회수하고 70% 에탄올이 포함된 35mm 조직 배양 접시에 배아를 5-10초 동안 담가 살균합니다.
   7. 이송 피펫을 사용하여 멸균 E2 배지가 들어 있는 E2 배지 1 접시로 배아를 옮겨 과도한 에탄올을 세척합니다.
   8. 배아를 E2 Media 2 접시에 옮기고 날카로운 집게로 융모막을 제거합니다.
   9. 배아를 최종 E2 Media 3 접시로 옮겨 해부를 수행합니다.
   10. 한 쌍의 가는 집게를 사용하여 망막을 절개합니다.
   11. 집게 중 하나로 배아를 난황 앞쪽에 배치하고 잡고 다른 집게로 꼬리를 난황낭 뒤쪽으로 제거합니다.
   12. 집게로 목을 잡고 머리를 벗어 뇌와 눈을 E2 매체에 노출시킵니다. 노른자 주머니를 자르지 마십시오.
   13. 가는 집게 끝으로 두 번째 집게로 두개골 조직을 아래로 잡고 머리에서 눈을 부드럽게 굴립니다. 인접한 조직 파편으로부터 눈을 분리하십시오.
   14. ZFCM(+)이 들어 있는 미리 준비된 튜브 중 하나에 4개의 눈을 이식합니다.
   15. P20 피펫과 노란색 팁으로 약 45회 위아래로 부드럽게 적정하여 세포를 해리합니다. 기포를 피하십시오.
   16. 해리된 세포가 있는 ZFCM(+)을 커버슬립의 중앙으로 옮깁니다. 추가 커버슬립에 대해 10-12단계를 반복합니다.
   17. 진동을 흡수하기 위해 폴리스티렌 폼 랙에서 22°C의 벤치탑에서 배양물을 유지합니다.
   18. 도금 후 6-24시간 후에 이미징을 수행합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 배양 접시	사르슈테트	83-3900
Calcium Chloride Dihydrate (염화칼슘 이수화물)	피셔 사이언티픽	C79-500
커버 유리	코 닝	2850-22
일회용 페트리 접시 (100 x 15mm)	폭스바겐	제25384-094
소 태아 세럼	써모피셔 사이언티픽	26140087
포도당	시그마 알디치	G7528 (영문
헤페스	시그마 알디치	H4034
라미닌	써모피셔 사이언티픽	23017-015
페놀 레드가 없는 Leibovitz의 L-15 미디엄	Gibco/Fisher Scientific	Tel.: 21-083-027
PBS (PBS)	하이클론/피셔 사이언티픽	SH3025601
페니실린/스트렙토마이신	써모피셔 사이언티픽	15140122
폴리-D-라이신(PDL)	시그마 알디치	P7280
나트륨 피루브산	시그마 알디치	P5280
Steritop 0.22μm 필터	밀리포어	S2GPT05RE

년 년 호 ) 년 (영문) (영문)