혈액 유래 만능 줄기 세포에서 신경 세포 생성

초록

출처: Becker-Kojić, Z. A., et al. GM이 없는 혈액 유래 신경 세포 생성. J. Vis. 특급 (2021).

이 동영상은 혈액 유래 만능 줄기 세포(BD-PSC)에서 신경 세포를 생성하는 기술을 보여줍니다. BD-PSC는 혈액 전구 세포를 재프로그래밍하여 얻습니다. 미분화 BD-PSC는 신경 유도 배지와 신경 분화 배지를 사용하여 세포 배양 기질로 코팅된 커버슬립에서 배양되어 신경 표현형을 가진 세포로의 분화를 유발합니다.

프로토콜

실험을 수행할 때 윤리적 승인을 받았습니다.

1. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMNC)의 분리

1. 모든 헌혈자가 기관 지침에 따라 혈액을 회수하기 전에 정보에 입각한 동의서에 서명했는지 확인하십시오.
2. 표준 프로토콜에 따라 훈련된 의료진이 건강한 헌혈자로부터 30mL의 혈액을 채취합니다.
3. 밀도 구배 매체(density gradient media)로 PBMNC를 분리합니다. 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석한 1:1 혈액 25mL와 함께 배지 10mL를 사용하고 300 x g에서 30분 동안 원심분리합니다.
4. 피펫팅을 통해 플라즈마와 밀도 구배 매체 사이의 계면층을 분리하십시오. 분리된 세포를 5mL의 멸균 PBS와 원심분리기로 300 x g에서 10분 동안 세척하고 두 번 반복합니다.
5. 계수 챔버를 사용하는 표준 방법으로 세포 수를 계산합니다.

2. PBMNC 표면의 항체 가교결합에 의한 인간 glycosylphosphatidylinositol (GPI) 고정 당단백질의 활성화

1. 6 x 10⁶ 단핵 세포(MNC)를 15mL 튜브에 넣고 37°C에서 1% 소 혈청 알부민(BSA)과 함께 PBS에서 30분 동안 인간 GPI 연결 막 단백질 특이적 항체(30μg/mL)로 세포를 배양하여 항체 교차결합을 수행합니다.
2. 배양 배지를 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Iscove의 변형된 Dulbecco의 배지로 교체합니다.
3. 15mL 폴리스티렌 튜브에서 세포를 성장시키고 튜브를 37 ° C 및 5 % CO₂의 인큐베이터에 8-10 일 동안 (흔들지 않음) 넣습니다. 5일차(D5)에 각 15mL 튜브에 10% FBS가 보충된 Iscove의 배지 1-2mL를 추가합니다.

3. 새로 생성된 역분화화된 셀의 정렬

1. 자동 세포 계수기(18 μL 세포 현탁액 + 2 μL 형광 염료) 또는 계수 챔버에서 세포를 계수합니다.
2. 300 x g에서 10분 동안 원심분리기 배양 세포 현탁액(5-7 x 10,⁶)을 배양하고 생성된 상등액을 멸균 파스퇴르 피펫으로 흡인합니다.
3. 90μL의 사전 냉각된 PBS pH 7.2, 0.5% BSA 및 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)에 셀 펠렛을 다시 현탁시킵니다.
4. 세포 현탁액에 CD45 positive nano sized magnetic beads(80 μL)를 추가하고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.
5. 2mL의 PBS 완충액과 원심분리기를 300 x g에서 10분 동안 첨가하여 세포를 세척합니다.
6. 500μL의 PBS 완충액에 세포를 다시 현탁시킵니다.
7. 500μL의 사전 냉각된 PBS 버퍼로 컬럼을 세척하고 자기장에 놓습니다.
8. 세포 현탁액을 컬럼에 놓고 500μL의 PBS 완충액(2회)과 CD45 음성 세포를 포함하는 원심분리 흐름으로 세척합니다. 1% BSA가 보충된 Iscove의 배지에 모으십시오.
9. 계수 챔버의 세포를 계수합니다.

4. 새로 생성된 줄기세포의 신경세포 분화를 위한 세포 배양 접시 준비

1. 신경 세포를 성장시키기 위해 배양 용기를 폴리-L-오르니틴과 라미닌으로 코팅합니다.
2. 유리 커버슬립을 4웰 플레이트에 넣고 ddH_2O에 1:5 희석된 폴리-L-오르니틴(이중 증류수[ddH₂O]에 0.1mg/mL)을 코팅합니다. 커버슬립을 37°C 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 그런 다음 ddH₂O로 씻으십시오.
3. 라미닌(0.5-2.0mg/mL)을 천천히 해동하고 커버슬립 상단에 추가합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
4. Dulbecco의 변형된 Eagle 배지/영양 혼합물 F-12(D-MEM/F12) 49mL, N2 보충제 500μL, 비필수 아미노산(NEAA) 400μL, 20ng/mL 최종 농도의 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF) 용액(100μg/mL 원액에서 준비) 및 2ng/mL 최종 농도의 헤파린으로 구성된 신경 유도 배지 N2를 준비합니다.
5. 피펫팅으로 과도한 라미닌을 제거하고 배양 접시에 뉴런 배지 N2를 첨가합니다.

5. 신경 세포가 분화되지 않은 혈액 세포의 배양

1. 라미닌/오르니틴 코팅 유리 커버슬립에서 BD 유래 CD45 음성 세포를 37°C 및 N2 배지에서 5% CO₂로 2일 동안 배양하여 새로 BD 생성된 세포의 신경 분화를 시작합니다.
2. 48 mL의 Neurobasal 배지, 500 μL의 L-글루타민, 1 mL의 B27 보충제, 500 μL의 NEAA, 50 μL의 재조합 인간 신경교 유래 신경 영양 인자 (GDNF) 50 μL로 구성된 신경 세포 분화 배지에서 세포를 추가로 배양하고, PBS / 0.1 % BSA 및 50 μL에서 5 μg / 200 μL의 재조합 인간 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF)로 구성된 신경 세포 분화 배지에서 세포를 추가로 배양합니다. PBS에서 아스코르브산 용액 2.9g/50mL의 μL. 플레이트를 37°C 및 5% CO₂의 인큐베이터에 넣습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알부민 분수 V	로스	T8444.4
AO/PI 세포 생존도 키트	바이오짐	872045	Biozym 단종 로고스 바이오시스템즈(Logos Biosystems)에서 생산한 제품입니다.
아스코르브산 2-인산염 세퀴마그네스	시그마 알드리치	A8960-5G
B27 세럼 프리 50x	피셔 사이언티픽(Gibco)	11530536
기본 FGF 솔루션	피셔 사이언티픽(Gibco)	10647225
바이오콜	머크 밀리포어	L6115-BC	밀도 그라디언트 미디어
BSA 프랙 V 7.5%	지브코	15260037
CD45 마이크로비즈	밀테니	Tel.: 130-045-801	나노 크기의 마그네틱 비드
세포 계수 슬라이드 Luna	바이오짐	872010	Biozym 단종 로고스 바이오시스템즈(Logos Biosystems)에서 생산한 제품입니다.
D-멤/F12	머크 밀리포어	FG4815-BC
FBS(증권 시세	머크 밀리포어	S0115/1030B	중단. 다음에서 사용 가능: TMS-013-B
GDNF 재조합 인간	피셔 사이언티픽(Gibco)	10679963
글루타맥스 100배	지브코	35050038	L-글루타민
헤파린 나트륨 세포	시그마-알드리치	H3149-50구
인간 BDNF	피셔 사이언티픽(Gibco)	11588836
이스코브(IMDM)	바이오크롬	FG0465
라미닌 마우스	피셔 사이언티픽(Gibco)	10267092
Luna FL 자동 세포 계수기	바이오짐	872040	Biozym 단종 로고스 바이오시스템즈(Logos Biosystems)에서 생산한 제품입니다.
MACS 버퍼	밀테니	Tel.: 130-091-221
멤 네아 100x	지브코	11140035
MiniMACS Trennsäulen	밀테니	Tel.: 130-042-201
Multiplatte Nunclon 4 우물	피셔 사이언티픽	10507591
N2 보충제 100x	피셔 사이언티픽(Gibco)	11520536
Neurobasal 배지	지브코	10888022
PBS 멸균	로스	9143.2
폴리-L-오르니틴	시그마-알드리치	P4957-50ML

시리즈 표시기 시리즈