자기 플랫폼에서 자기 나노 입자가 적재된 뉴런의 성장과 분화

초록

출처: Indech, G., et al. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 세포내이입(endocytosis)을 통해 신경 세포가 형광 자기 나노 입자(MNP)를 흡수하는 것을 보여줍니다. 자기 패턴의 기질에서 이러한 MNP 부하 뉴런을 성장시키면 세포가 부착될 수 있습니다. 배지를 포함하는 성장 인자의 추가는 뉴런 확장의 성장을 돕고, 기질의 자기장은 확장의 방향을 지시합니다.

프로토콜

1. 세포 자기 나노 입자 (MNP) 흡수

1. Roswell Park Medical Institute(RPMI) 배지에 10% 말 혈청(HS), 5% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 0.2% 암포테리신을 첨가하여 PC12 세포 배양을 위한 기본 성장 배지를 준비하고 0.22μm 나일론 필터를 사용하여 필터링합니다.
2. RPMI 배지에 1% 호스 세럼(HS), 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 0.2% 암포테리신을 첨가하여 PC12 분화 배지를 준비하고 0.22μm 나일론 필터를 사용하여 필터링합니다.
3. 10 mL의 염기성 성장 배지를 가진 처리되지 않은 배양 플라스크에서 세포를 성장시키고, 2-3일마다 10 mL의 염기성 성장 배지를 플라스크에 첨가하고, 8일 후에 세포를 과소 배양합니다.
4. 세포 흡수를 위해 원심분리 튜브에 세포 현탁액을 200× 실온에서 8분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
5. 3mL의 신선한 염기성 성장 배지에 세포를 재현탁시킵니다. 다시 200 × g 및 실온에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 3mL의 새로운 분화 배지에 세포를 재현탁합니다.
6. 주사기와 바늘을 사용하여 세포를 10배 흡인하여 세포 클러스터를 분해합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세고 코팅되지 않은 일반 35mm 접시에 10⁶ 세포를 파종합니다.
7. 원하는 MNP 농도와 총 부피를 달성하기 위해 계산된 MNP 현탁액의 부피와 분화 배지의 부피를 접시에 추가합니다. 세포, MNP 및 분화 배지를 혼합합니다. 5 % CO₂ 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 24 시간 동안 접시를 배양합니다.
8. 세포 현탁액을 실온에서 200 ×g에서 5분간 원심 분리한 후 상층액을 버립니다. 1mL의 새로운 분화 배지에 세포를 재현탁하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.

2. 자기 플랫폼에서의 세포 분화 및 성장

1. 패턴이 있는 기판을 70% v/v/에탄올로 청소하고 기판을 후드의 35mm 배양 접시에 넣습니다. 패턴이 있는 기판 아래에 큰 자석(~1500 Oersted)을 1분 동안 놓고 먼저 접시를 자석에서 위로 움직여 자석을 제거한 다음 후드에서 자석을 꺼냅니다. 자외선을 15분 동안 켭니다.
2. 콜라겐 유형 1 (쥐 꼬리에서 추출한 용액)을 30 % v / v 에탄올에 1:50으로 희석하여 기질을 콜라겐 유형 1로 코팅합니다. 35mm 접시를 코팅하려면 30% 에탄올 1mL에 콜라겐 20μL를 추가합니다.
3. 용액으로 접시를 덮고 모든 용액이 증발할 때까지 기다렸다가 몇 시간 동안 접시를 덮지 않은 상태로 두십시오. 멸균 1x PBS에서 3x 세척; 유리 슬라이드는 세포 파종을 위한 준비가 되었습니다.
4. 세포 MNP 흡수 후 세포를 현탁시키고, 35mm 배양 접시에 10⁵ 세포를 시딩하고, 2mL의 분화 배지를 첨가합니다. 37°C에서 5% CO2, 가습된 인큐베이터에서 배양물을 배양합니다.
5. 24시간 후 1:100 신선한 쥐 β-NGF(최종 농도 50ng/mL)를 추가합니다. 분화 배지를 갱신하고 2일마다 신선한 쥐 β-NGF를 추가합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6웰 세포 배양 플레이트	송골매	353846
96웰 세포 배양 플레이트	SPL 생명 과학	30096
암포테리신 B 용액	생물 산업	03-028-1B
소 혈청 알부민(BSA)	생물 산업	03-010-1B
세포 및 조직 배양 플라스크	바이오필	TCF002250	75.0 cm^2 250 mL 벤트 캡, 비처리
세포 배양 접시	Greiner 바이오 원	627-160	35의 mm
원심분리기 튜브	바이오필	CFT021500	50 밀리리터
콜라겐 타입 I	코닝 Inc.	354236	쥐 꼬리, 농도 범위 3-4 mg/mL
일회용 바늘	케이디엘		23 지
일회용 주사기	메디스포	1160227640	10 밀리리터
기증자 말 세럼	생물 산업	04-124-1ᄀ
에탄올 70%	로미컬 주식회사	제19-009102-80
에탄올 앱솔루트 (탈수)	Biolab-chemicals	52505
소 태아 혈청(FBS)	생물 산업	04-127-1ᄀ
신선한 쥐 β-NGF	페프로텍	450-34
GMW C-프레임 전자석 .	버클리 시스템 LTD		3470, 45 밀리미터
L-글루타민	생물 산업	03-020-1B
PBS 10배	하이랩스	BP507/1LD
PC12 세포주	증권 시세	CRL-1721
페니실린-스트렙토마이신 니스타틴 용액	생물 산업	03-032-1B
RPMI 1640(L-글루타민 포함	생물 산업	01-100-1ᄀ

년 호 년 년 표시기 (영문) )