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1. 인간 배아 줄기 세포(hESC) 인증 기저 멤브레인 매트릭스 코팅 플레이트의 준비
- 겔 형성을 방지하기 위해 hESC 인증 기저막 매트릭스(재료 표 참조) 용액을 4°C에서 최소 2-3시간 동안 또는 밤새 천천히 해동합니다.
- 기저막 매트릭스 코팅 플레이트를 준비하려면 F12(DMEM+F12)를 사용하여 저온 Dulbecco의 Modified Eagle Medium에서 매트릭스를 2% 최종 농도로 희석합니다. 6웰 플레이트의 각 웰을 잘 섞어 1mL의 희석된 매트릭스 용액으로 코팅합니다.
- 기저막 매트릭스 코팅 플레이트를 실온(RT)에서 최소 3시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.
메모: 기저막 매트릭스가 있는 플레이트는 매트릭스 용액을 제거하고 플레이트를 사용하기 전에 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 단일 세포 hESC 배양에 대한 집락 유형 hESC의 적응
- 기저막 매트릭스에서 자란 콜로니 유형 H9(WA09) hESC의 피더가 없는 배양물을 통과시키려면 웰에서 배지를 흡인합니다(그림 1A).
- DPBS 1mL로 1x 세척합니다. 웰당 1mL의 디스페이즈 용액(1U/mL)을 추가하고 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
- 디스파제를 제거하고, 2mL의 DMEM/F12로 셀을 1회 부드럽게 세척하고, 배지를 제거하고, 각 플레이트에 2mL의 DMEM/F12를 추가합니다.
- 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 콜로니를 부드럽게 분리하고 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 펠릿을 370 x g에서 2분 동안 원심분리하고 배지를 흡입합니다.
- 세포 펠릿을 단일 세포로 해리하려면 세포 분리 용액 2mL(1x 농도, 재료 표 참조)를 추가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 370 x g에서 2분 동안 세포를 원심분리하고 분리 용액을 제거합니다.
- 새로운 mTeSR1 인간 배아줄기 배지를 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 단일 세포로 해리합니다.
- 콜로니 유형 hESC를 단일 세포 유형 배양에 적용하려면 10μM ROCK 억제제가 포함된 mTeSR1 2mL에 약 1.5–2.0 x 106 hESC를 기저 멤브레인 매트릭스 코팅된 6 웰 플레이트의 각 웰에 24시간 동안 플레이트합니다(그림 1A).
- 24시간 후, hESC 배지를 ROCK 억제제가 없는 새로운 mTeSR1로 교체하고 hESC가 3일 동안 단일 세포 유형으로 성장하도록 합니다. 매체를 매일 교체하십시오.
- 4일차에 배양액이 거의 100% 포화도에 도달하면 분리 용액에서 세포를 해리한 다음 2.6.
단계에 설명된 대로 다시 플레이팅합니다.
메모: ROCK 억제제는 단세포 유형 hESC 배양의 초기 24시간 동안 세포 생존을 향상시킵니다.
3. 단일 셀 유형 hESC를 NPC로 분화(그림 2)
- NPC 분화를 유도하기 위해 단일 세포 유형 hESC를 1mL의 분리 용액(1x)으로 해리하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 370 x g에서 2분 동안 세포를 원심분리하고 박리 용액 상층액을 제거합니다. DMEM/F12 1mL를 첨가하고 부드러운 피펫팅으로 세포를 재현탁합니다.
- 10μM ROCK 억제제를 함유한 2mL의 mTeSR1 내 2 x 105개 세포/웰의 밀도로 기저막 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트의 플레이트 세포.
- 24시간 후, 배양 배지를 1μM 도르소모르핀과 5μM SB431542이 보충된 신경 유도 배지(1% B27에서 비타민 A를 뺀 DMEM)로 교체합니다.
- 신경 유도의 처음 4일 동안은 격일로 배지를 바꾸고, 그 다음에는 7일째에 합류점에 도달할 때까지 매일 배지를 바꿉니다(그림 2B).
참고 : (1) Dorsomorphin은 ALK2,3,6 수용체를 표적으로 삼아 BMP 경로를 억제하고 AMPK도 억제합니다. SB431542는 ALK5,7을 표적으로 하는 TGFβ/Activin 경로의 억제제입니다. (2) 동일한 프로토콜을 다른 ESC 라인(WA01)으로 테스트한 결과 WA09와 유사한 결과가 나왔습니다. (3) 우리는 일반적으로 기저막 매트릭스에 Matrigel을 사용했습니다. 그러나 Geltrex에서 세포를 배양한 다음 여러 NPC 마커의 발현에서 알 수 있듯이 매우 유사한 결과를 가진 NPC로 분화할 수 있습니다(그림 3D, E). Matrigel과 동일한 방식으로 Geltrex를 취급합니다(섹션 1 참조).
