성인 인간 뇌에서 자유 부유 슬라이스 배양 준비

초록

출처: Fernandes, A., et al. 성인 인간 뇌의 단기 자유 부동 슬라이스 배양. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 성인 인간의 뇌에서 자유 부유 슬라이스 배양을 준비하는 기술을 보여줍니다. 얇은 조각은 비브라톰을 사용하여 뇌 섹션에서 생성됩니다. 그런 다음 이러한 절편은 조직 생존력을 유지하기 위해 성장 인자로 보충된 배양 배지에 현탁됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 재료 살균

참고: 모든 재료와 용액은 사용 전에 멸균해야 합니다.

1. 모든 수술 도구와 비브라톰 슬라이싱 재료(나이프 홀더, 표본 디스크, 버퍼 트레이)를 건조 멸균 오븐에서 180°C에서 4시간 동안 멸균합니다.
2. 온도에 민감한 재료 또는 장비를 UV 또는 감마선 조사로 살균합니다.
3. 0.22μm 공극 멤브레인을 통한 오토클레이브 또는 여과를 통해 매체와 용액을 멸균합니다.

2. 솔루션 준비

1. 15-20mL의 수송 용액 준비: 50% v/v Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS) pH 7.4, 출생 후 및 성인 뇌 뉴런 유지를 위한 50% v/v 기초 배지(재료 표), 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES), 3mg/mL 포도당 및 33μg/mL 겐타마이신이 보충됩니다.
   메모: 운송 용액은 샘플을 채취하기 전에 최소 20분 동안 냉장 및 산소화(탄화 가스로 버블링)해야 합니다.
2. 300mL의 슬라이싱 용액(10mM HEPES 및 3mg/mL 포도당이 보충된 HBSS)을 준비하고 초기 결정 형성 지점까지 냉동고에서 냉각합니다.
3. 20mL의 배양 배지 준비: 1% L-글루타민 유도체(Table of Materials), 신경 배양을 위한 2% 보충제(Table of Materials), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 0.25μg/mL 암포테리신 B가 보충된 출생 후 및 성인 뇌 신경 유지를 위한 기저 배지(Table of Materials).

3. 슬라이싱 장치 설정

참고: 이 프로토콜은 수술실에서 검체 채취의 물류로 인해 동료의 도움을 받아 이상적으로 수행됩니다.

1. 소금이 첨가된 얼음 양동이에 슬라이스 용액을 사용하기 전에 최소 20분 동안 탄수화물 혼합물 버블링(95% O₂, 5% CO₂) 아래에 두십시오.
2. 3% 아가로스 블록(약 2cm x 2cm x 2cm)을 준비하고 슬라이스하는 동안 조직 샘플에 대한 추가 기계적 지지를 생성하기 위해 비브라톰 표본 디스크에 초접착합니다(그림 1E).
3. 슬라이싱을 위한 비브라톰 설정: 단면 두께 200μm, 진동 주파수 100Hz, 슬라이싱 속도 0.5-1.0mm/s 사이.
4. 비브라톰 버퍼 트레이를 비브라톰 베이스에 잠그고 얼음을 추가하여 슬라이스 용액과 s를 받기 전에 냉장 보관하십시오.ample, 그리고 슬라이싱 절차 전반에 걸쳐.

4. 샘플 수집

참고: 이 프로토콜에서는 인간 신피질 조직을 수술실에서 채취하여 실험실로 이송했습니다.

주의: 인체 샘플을 다룰 때는 기관에서 정한 적절한 안전 프로토콜을 따르십시오.

1. 다음으로 구성된 운송 장치(그림 1C)를 설정합니다: 가스 출력을 제어하는 압력/플럭스 밸브에 연결된 카보겐 혼합물이 있는 휴대용 가스 실린더, 가스 출력을 운송 용기에 연결하는 실리콘 튜브에 연결된 가스 출력;운송 용기, 일반적으로 가스 주입을 위한 구멍이 뚫린 뚜껑이 있는 50mL 원추형 원심분리기 튜브, 수송 용액을 함유하는 단계; 그리고 수송 도중 표본 냉각을 위한 얼음.
2. 검체(그림 1B)를 수집하여 즉시 실험실로 운송합니다. 시편을 냉간 운송 용액(탄수화물 혼합물로 지속적으로 거품을 일으킴)에 담그십시오.

5. 슬라이싱

1. 슬라이싱 용액이 들어 있는 페트리 접시(100mm x 20mm)로 표본을 옮기고 정밀한 수술 도구를 사용하여 샘플에 남아 있는 수막을 가능한 한 많이 조심스럽게 제거합니다(그림 1D).
2. 실험 설계의 특정 특성을 가진 슬라이스를 생성하기 위한 최상의 시편 방향을 선택하고 24번 메스 날을 사용하여 평평한 표면을 시편 디스크에 접착된 베이스로 다듬습니다.
3. 일회용 플라스틱 숟가락과 섬세한 붓을 사용하여 페트리 접시에서 조각을 수집하고 여과지를 사용하여 여분의 용액을 건조시킵니다(모세관으로 건조하고 조직 조각을 종이로 만지지 마십시오).
4. 초강력 접착제를 사용하여 조직이 디스크에 단단히 부착되고 아가로스 블록과 접촉할 때까지 조직을 비브라톰 표본 디스크에 부착합니다(그림 1E).
5. 비브라톰 표본 디스크(조직이 적절하게 부착된 상태)를 전체 프로세스 동안 거품이 발생해야 하는 슬라이싱 용액으로 채워진 비브라톰 버퍼 트레이에 놓습니다.
6. 면도날이 단단히 고정된 상태에서 칼 홀더를 제자리에 잠급니다.
7. 슬라이싱 용액은 시편과 블레이드를 모두 덮어야 하며, 그런 다음에야 슬라이싱을 시작합니다(그림 1F).
8. 시편을 200μm 슬라이스로 자릅니다.
   메모: 일부 진동자는 표본을 자동으로 절단하지만, 공정 중 면밀한 관찰과 슬라이싱 속도의 약간의 조정은 더 나은 슬라이스를 만드는 데 도움이 될 수 있습니다. 초기의 불규칙한 슬라이스는 버립니다.
9. 버퍼 트레이의 슬라이스를 슬라이스 용액이 있는 페트리 접시로 옮기고 느슨한 가장자리와 여분의 흰색 물질을 약 70% 피질/30% 백질의 비율로 다듬습니다.

6. 문화

참고: 멸균 환경의 층류 캐비닛에서 이 단계를 수행하십시오.

1. 웰당 600μL의 배양 배지(24웰 플레이트)를 추가하고 슬라이스를 플레이팅하기 전에 36°C 및 5% CO₂에서 최소 20분 동안 배양합니다.
2. 붓을 사용하여 우물당 한 조각을 플레이트합니다(그림 1G).
3. 플레이트에 사용하지 않은 웰이 있는 경우 400μL의 멸균수를 채웁니다.
4. 36 ° C, 5 % CO₂.
   에서 플레이트를 배양합니다. 메모: 첫 번째 매체 교체는 슬라이스의 크기에 따라 도금 후 8-16시간 이내에 수행해야 합니다.
5. 이전에 준비된 배양 배지 10mL에 50ng/mL 뇌 유래 신경영양인자(BDNF)를 보충합니다.
   메모: 처음 8-16시간 동안, 이 단계에서 배지 소비가 가속화되기 때문에 영양소 결핍 및 산성화를 방지하기 위해 슬라이스를 600μL의 배지에서 배양합니다. 다음 단계에서 웰당 배지의 부피를 400μL로 조정합니다.
6. 각 웰에서 컨디셔닝된 배지 333μL를 제거하고 새로운 BDNF 보충 배지 133μL를 추가합니다.
7. 컨디셔닝된 배지의 1/3을 새로운 BDNF 보충 배지로 교체하여 24시간마다 배지 교체 과정을 반복합니다.

결과

그림 1: 성인 인간의 피질 조직 샘플 수집, 운송, 절단 및 배양. 이 절차는 약물 내성 간질(A,B) 치료를 위해 측두엽 절제술에서 피질 조직을 채취하는 수술실에서 시작됩니다. (C) 조직 단편(n = 1)은 얼음처럼 차가운 산소 수송 매체를 포함하는 튜브로 즉시 전달됩니다(아래 참조). (D) 실험실에서는 정밀한 안과 핀셋을 사용하여 수막을 제거합니다. 여분의 액체는 여과지를 사용하여 건조하고, 단편을 백질이 아래를 향하고 pial 표면이 위를 향하도록 하여 비브라톰 표본 디스크에 초접착(E)합니다. (F) 상업용 면도기를 사용하여 표본을 200μm 조각으로 절단하고 섬세한 페인트 브러시로 수집하고 페트리 접시로 다시 옮겨 (G) 자유 부동 형식으로 도금 및 배양하기 전에 과도한 백질과 느슨한 끝단(표시되지 않음)...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	시그마 알드리치	A9539
과황산암모늄	시그마	A3678-25G
암포테리신 B	지브코	제15290-018
나27	지브코	제17504-044
증권 시세	시그마 알드리치	SRP3014
소 세럼 알부민	시그마 알드리치	A7906
포도당	머 크	108337
글루타맥스	지브코	제35050-061
행크스 밸런스드 솔트	시그마 알드리치	H1387-10X1L
헤페스	시그마 알드리치	H4034
신경기저 A	지브코	제10888-022
PBS 완충액 pH 7.2	라보르클린	590338
페니실린/스트렙토마이신	시그마 알드리치	P4333
장비 및 재료
카보겐 혼합물	화이트 마틴		95% O2, 5% CO2
CO2 인큐베이터	뉴브런즈윅 사이언티픽	코-24	슬라이스 5% CO2, 36ºC 배양
플라스틱 숟가락			디저트 숟가락의 크기
면도날	빅		크롬 플래티넘, 비브라톰으로 슬라이싱에 사용
메스 블레이드	벡턴 디킨슨(BD)	번호 24	조직을 자르는 데 사용됩니다. 동일한 크기 또는 더 작은 것이 권장됩니다
초강력 접착제 (록타이트 슈퍼 본더)	헨켈		구성: Etilcianoacrilato; 2-프로펜산; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-크레졸; 호모폴리머
비브라톰	라이카	14047235612 - VT1000S

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