Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free 배지를 이용한 쥐 뇌로부터의 미세아교세포(Microglia)

초록

출처: Collins, H. Y., et al., 무혈청 배지에서 동적 파원형 형태를 촉진하기 위한 설치류 미세아교세포의 분리 및 배양. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 쥐의 뇌에서 미세아교세포를 분리하고 배양하는 방법을 보여줍니다. 그것은 미세아교세포에 특이적인 단클론 항체로 코팅된 플레이트를 사용하여 다른 신경 세포와 비신경 세포에서 미세아교세포를 분리하는 것을 수반합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. CD11b 면역 판닝을 위한 페트리 접시 준비(0일차)

참고: 어린 쥐의 뇌 1-2개당 면역 판넬 접시 1개를 준비합니다.

1. 25cm 페트리 접시에 50mM Tris pH 9.5 용액 15mL를 추가합니다.
2. 염소 안티 마우스 IgG(H+L 사슬)를 접시에 추가하여 최종 농도를 6μg/mL로 만듭니다. 고르게 분포시키기 위해 플레이트를 소용돌이치십시오.
3. 접시를 37 ° C에서 1 - 3 시간 동안 배양하십시오.
4. DPBS++(Ca²⁺ 및 Mg²⁺를 함유한 인산염 완충 식염수(PBS))로 접시를 세 번 헹군 다음 1μg/mL OX42 항체가 함유된 패닝 완충액 용액으로 교체합니다. 접시는 평평한 표면에 실온에서 밤새 그대로 두십시오.

2. 조직 채취 (1일차)

참고: 이 프로토콜은 ~3 - 4시간이 소요됩니다.

1. 시작하기 전에 모든 용액이 멸균되고 얼음 위에서 냉각되었는지 확인하십시오. 모든 기구를 얼음으로 식히고 사용하기 전에 에탄올로 살균하십시오.
2. 적절한 규제 절차에 따라 이산화탄소 질식으로 어린 실험실 쥐를 희생시킵니다.
   메모: 또는 어린 동물에게 치사량의 케타민/자일라진(24mg/mL 케타민 100 - 200μL, 2.4mg/mL 자일라진)을 희생할 수 있습니다. 케타민/자일라진은 동물이 생후 14일 미만인 경우 사용해야 합니다. 여러 동물을 사용하는 경우 한 동물에서 조직을 추출하여 얼음 위에서 미리 냉각된 DPBS⁺⁺에 넣은 후 다음 동물로 진행합니다.
3. 진행하기 전에 뒷발을 꼬집고 동물이 완전히 반응하지 않는지 확인하십시오.
4. 완충액이 투명해질 때까지 271/2-G 바늘을 사용하여 10 - 30mL의 얼음처럼 차가운 관류 완충액으로 동물을 경심 관류합니다.
   메모: 관류 완충액의 부피는 동물의 크기/나이에 따라 달라집니다.
5. 관류 직후 동물의 머리를 제거하십시오. 척수에서 들어와 박리 가위로 양쪽의 후두과를 자르고 뇌를 손상시키지 않도록주의하십시오. 양쪽을 조심스럽게 자른 후 두정골과 전두골을 따라 한쪽을 코뼈 쪽으로 자릅니다. 겸자로 두개골 상단을 조심스럽게 뒤로 당기고 뇌(또는 관심 CNS 구조)를 빠르게 제거한 다음 미리 식힌 ^DPBS++에 얼음 위에 놓습니다.
6. 나머지 모든 동물에 대해 반복합니다.
   메모: 모든 진행 단계는 적절한 멸균 조건의 층류 후드에서 수행해야 합니다.

3. 기계적 해리 (1일차)

1. 모든 뇌를 채취한 후, 차가운 메스 칼날을 사용하여 얼음 위의 페트리 접시에 담긴 뇌 하나를 1mm³ 덩어리로 자르고, 5 - 7 mL의 얼음처럼 차가운 도운싱 버퍼가 있는 얼음처럼 차가운 도운싱 균질기로 옮깁니다. 한 번에 하나의 뇌를 해리합니다.
2. 헐렁한 dounce 균질화기로 10-20번의 부드럽고 불완전한 스트로크를 사용하여 조직을 해리합니다. 균질화기 바닥의 조직을 직접 부수지 않도록 주의하고 대신 피스톤과 균질화기 측면 사이의 공간을 통해 조직을 밀어 넣으십시오.
3. 기포가 유입되지 않도록 피스톤을 조심스럽게 제거하십시오. 해리가 잘 되지 않은 조직 덩어리가 균질기의 바닥에 가라앉도록 하고 상층액을 새로운 냉각된 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다.
4. 제거된 부피를 새로운 도운싱 버퍼로 교체하고 3.2 및 3.3 단계를 총 3 - 4 라운드 동안 또는 모든 조직이 분리될 때까지 반복합니다. 각 브레인에 대해 절차를 반복합니다.

4. 수초제거 (1일차)

참고: 수초제거술은 P12보다 나이가 많은 동물로부터 미세아교세포를 분리하는 데 사용됩니다.

1. 25mL 피펫을 사용하여 50mL 코니컬 튜브의 세포 현탁액 부피를 측정한 다음 얼음처럼 차가운 도운싱 버퍼를 추가하여 총 부피를 33.5mL로 조정합니다.
2. 세포 현탁액에 10mL의 미엘린 분리 완충액(MSB)을 추가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 완전히 혼합합니다. 그 결과 43.5mL의 부피에서 MSB의 최종 농도가 23%
가 됩니다.
3. 4°C에서 500 x g, 저속 제동으로 15분 동안 원심분리기 셀.
   메모: 원심분리기가 감속하는 데 약 1.5 - 2분 정도 걸립니다. 이것은 미엘린과 죽은 세포 파편의 상층, 다소 탁한 상층액, 그리고 살아있는 세포를 위해 농축된 더 작은 펠릿을 생성할 것입니다.
4. 피펫으로 미엘린/파편과 상층액의 최상층을 제거합니다. 상단 레이어를 제거할 때 가능한 한 많이 제거되도록 주의하십시오.
5. 세포 펠렛을 12mL의 패닝 버퍼에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 부드럽게 분쇄하여 남아 있을 수 있는 세포 덩어리를 분해합니다.

5. 면역판닝(1일차)

1. 70μm 세포 여과기에 세포 현탁액을 통과시켜 큰 파편이나 세포 덩어리를 제거합니다.
2. OX42 코팅된 패닝 접시를 DPBS++로 세 번 헹굽니다. 세탁 사이에 접시가 완전히 마르지 않도록 하십시오.
3. 마지막 DPBS++ 세척을 붓고 여과된 세포 현탁액을 패닝 접시에 적용합니다. 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 세포를 분산시킨 다음 세포가 부착될 수 있도록 실온의 평평한 표면에 플레이트를 20분 동안 배양합니다. 20분 이상 배양하지 마십시오. 그렇지 않으면 접시에서 세포를 회복하기가 매우 어려워집니다.
4. 패닝 접시를 DPBS++로 10회 헹구어 비부착 세포를 제거합니다. Microglia는 플레이트에 단단히 부착되므로 헹굴 때마다 플레이트를 휘젓고 다른 비부착성 세포를 제거할 수 있습니다.
5. 마지막 ^DPBS++ 세척을 붓고 15mL DPBS++ 및 200μL 트립신(1.25% 원액)으로 교체합니다.
6. 37°C에서 ≤10% CO₂로 10분 동안 접시를 배양하여 트립신화합니다.
   메모: 10분 이상 계속하지 마십시오. 그렇지 않으면 미세아교세포를 제거하기 어려워집니다.
7. 트립신화 10분 후에도 미세아교세포는 여전히 플레이트에 붙어 있습니다. 트립신/DPBS⁺⁺를 붓고 DPBS⁺⁺로 2번 부드럽게 씻어 트립신을 제거한 후 12mL의 얼음처럼 차가운 미세아교세포(MGM)로 교체합니다.
8. 세포/기질 상호 작용을 약화시키는 데 도움이 되도록 얼음 위에 패닝 접시를 2분 동안 놓고 패닝 접시 영역이 마르지 않도록 접시가 평평한지 확인합니다.
9. 10mL 피펫과 피펫 컨트롤러를 사용하여 고속으로 격렬하게 피펫팅하여 패닝 접시에서 세포를 회수합니다. 피펫에서 액체가 흐르는 16 x 16 그리드를 그려 모든 세포를 제거합니다.
10. 20X 배율로 현미경으로 세포를 검사하여 세포가 플레이트에서 분리되었는지 확인합니다. 접시 위에 세포가 여전히 붙어 있는 부분을 표시하고 해당 영역에서 피펫팅을 반복합니다.
11. 세포 현탁액을 수집하고 15-mL 코니컬 튜브당 3 - 4mL의 상층액을 분취합니다. 저속 제동으로 4°C에서 500 x g로 15분 동안 회전합니다.
    메모: 작은 부피를 통해 미세아교세포를 회전시키면 세포의 최대 회복이 가능합니다.
12. 상층액을 흡인하고 세포 펠렛과 함께 0.5mL의 MGM을 남깁니다.
13. 각 펠릿을 잔여 MGM에 재현탁시키고 모든 튜브에서 세포를 풀링합니다.
14. 혈구계로 세포를 세십시오.
15. 응용 프로그램에 따라 6 - 7단계에 설명된 대로 플레이트 셀.
16. 37°C에서 10% CO₂.
    로 세포 배양 메모: 세포는 정기적인 배지 교체로 최대 3-4주 동안 또는 배지 변화 없이 1주일까지 배양할 수 있습니다.

6. 스폿 코팅 조직 배양 플레이트/커버슬립(1일차)

1. 24웰 음이온/양이온 코팅 조직 배양 플레이트의 중앙에 직접 콜라겐 IV 코팅을 15μL로 플레이트화하고(자세한 내용은 재료 표 참조) 10% CO₂로 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
2. 혈구계로 세포를 계수한 후 MGM에서 세포를 2.3 x 10⁵/mL로 희석합니다. 콜라겐 IV 반점을 흡인하고 즉시 15μL의 세포 현탁액을 이 반점에 플레이트화합니다. 이것은 3.5 x 10³ 셀/스폿을 제공합니다. 세포가 부착 할 수 있도록 37 ° C에서 10 % CO₂로 5-10 분 동안 배양하고 성장 배지 (TIC)를 함유 한 CO₂- 평형 TGF-β2 / IL-34 / 콜레스테롤 500 μL를 웰에 부드럽게 첨가합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
버퍼 도핑			레시피: 50mL의 DPBS++ 에 0.4% DNaseI 200μL 코멘트: 얼음처럼 차가울 때 사용
패닝 버퍼			레시피: DPBS++의 우유 고형분에서 추출한 펩톤 2mg/mL
미세아교세포 성장 배지(MGM)			레시피: 페니실린 100단위/mL, 스트렙토마이신 100μg/mL, 글루타민 2mM, N-아세틸 시스테인 5μg/mL, 인슐린 5μg/mL, 아포-트랜스페린 100μg/mL 및 아셀렌산나트륨 100ng/mL 를 함유한 DMEM/F12 코멘트: 얼음처럼 차가운 MGM을 사용하여 이미징 접시에서 미세아교세포를 벗겨냅니다.
콜라겐 IV 코팅			레시피: 2 μg/mL 콜라겐 IV를 함유한 MGM
미엘린 분리 완충액			레시피: 9mL Percoll PLUS, Ca++ 및 Mg++ 제외 1mL 10x PBS, 9μL 1M CaCl2, 5μL 1M MgCl2 코멘트: CaCl2와 MgCl2를 첨가한 후 잘 섞는다
트립신	시그마	T9935
DMEM/F12	지브코	21041-02
페니실린/스트렙토마이신	지브코	15140-122
DMEM(고포도당)	지브코	11960-044
콜라겐 IV			재구성: PBS 에서 200μg/mL 사용 농도 : 1 : 100 보관 : -80 °C
마우스 anti-rat CD11b 단클론 (클론 OX42)	바이오 라드	MCA275R	패닝: 1:1,000; 염색 : 1:500
TGF-b2/IL-34/콜레스테롤 함유 성장 배지(TIC)			레시피: 인간 2ng/mL TGF-b2, 100ng/mL 뮤린 IL-34, 1.5μg/mL 양모 콜레스테롤, 10μg/mL 헤파란 황산염, 0.1μg/ml 올레산 및 0.001μg/ml 곤도산 을 함유한 MGM 코멘트: 37°C로 예열된 매체에 콜레스테롤을 첨가하고 1.5μg/mL 이상을 첨가하지 마십시오. 콜레스테롤 함유 매체를 여과하지 마십시오. 최적의 pH를 보장하기 위해 세포에 추가하기 전에 30분-1시간 동안 TIC 배지를 10% CO2로 평형을 이룹니다.
퍼콜 플러스	GE 헬스케어	카탈로그 # 17-5445-02
Primaria 플레이트	폭스바겐	고양이# 62406-456
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