NMDG 기반 보호 회복 방법을 사용한 뇌 절편 준비

초록

출처: Ting, J. T. et al. 최적화된 N-메틸-D-글루카민 보호 회복 방법을 사용한 급성 뇌 절편 준비. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 NMDG(N-Methyl-D-glucamine) 기반 보호 회복 방법을 사용하여 뇌 절편을 얻는 프로토콜에 대해 설명합니다. 절개된 뇌는 NMDG와 HEPES가 있는 aCSF에서 배양되어 절편 중 신경 세포 사멸 및 손상을 최소화합니다. 이 섹션은 aCSF에서 복구하여 셀룰러 활동을 복원할 수 있습니다

프로토콜

1. 뇌 해부 및 슬라이스

1. 동물의 목을 베십시오. 메스를 사용하여 머리의 피부를 열고 두개골 뚜껑을 노출시킵니다.
2. 가느다란 슈퍼 컷 가위를 사용하여 두개골 뚜껑 위의 피부를 잘라내고 두개골의 꼬리/복부 기저부에서 양쪽 측면으로 작은 절개를 만듭니다. 두개골의 꼬리/등쪽 쪽에서 시작하여 밑에 있는 뇌가 손상되지 않도록 주의하면서 등쪽 정중선 위로 위쪽 방향으로 얕게 추가로 절단합니다. 후각 전구 수준에서 정중선에 수직으로 최종 'T'자를 만듭니다.
   메모: 관심 있는 뇌 영역에 손상이 가해지지 않도록 주의를 기울여야 합니다. 특히 뇌 자체에 어떠한 압박력도 가해
져서는 안 된다.
3. 둥근 끝 집게를 사용하여 두개골을 잡고 상부-내측 측면에서 시작하여 꼬리-측면 방향으로 다시 벗겨냅니다. 양쪽이 갈라져 열리도록 반복하고 두개골 뚜껑의 등쪽 절반을 제거하여 뇌를 노출시킵니다. 온전한 뇌를 미리 식힌 NMDG-HEPES aCSF의 비커에 부드럽게 퍼냅니다. 뇌가 ~1분 동안 균일하게 냉각되도록 합니다.
4. 큰 주걱을 사용하여 비커에서 뇌를 들어 올려 여과지로 덮인 페트리 접시 위에 올려 놓습니다. 선호하는 절단 각도와 원하는 뇌 관심 영역에 따라 뇌를 다듬고 차단합니다. 취급 중 장기간 산소 결핍을 피하기 위해 신속하게 작업하십시오.
   메모: 많은 슬라이싱 각도가 가능합니다. 정확한 차단 방법과 슬라이싱 각도는 연구할 정확한 뇌 영역, 세포 유형 및 회로에 따라 달라집니다.
5. 접착 접착제를 사용하여 시편 홀더에 뇌 블록을 부착합니다. 뇌 블록이 완전히 내부로 빠져나갈 수 있도록 표본 홀더의 내부 부분을 집어넣습니다. 뇌 블록이 아가로스로 완전히 덮일 때까지 용융된 아가로스를 홀더에 직접 붓습니다. Clamp 아가로스가 응고될 때까지 ~10초 동안 시편 홀더 주위에 미리 냉각된 액세서리 냉각 블록을 돌립니다.
6. 시편 홀더를 슬라이서 기계의 소켓에 삽입하고 적절한 정렬을 확인합니다. 250mL 비커에서 미리 냉각되고 산소가 공급된 NMDG-HEPES aCSF로 저장소를 채우고 적절한 산소화를 보장하기 위해 절단하는 동안 버블 스톤을 저장소로 이동합니다.
7. 마이크로미터를 조정하여 아가로스가 박힌 뇌 표본을 진행하기 시작합니다. 슬라이서를 시작하고 진행 속도와 진동 주파수를 원하는 수준으로 경험적으로 조정합니다.
   메모: 두 설정 모두 낮은 범위에 있어야 합니다. 최상의 결과를 얻으려면 블레이드 암을 한 번 통과하는 데 약 20초가 소요되어야 하며 진동은 명백한 윙윙거림 없이 매우 부드럽고 부드러운 윙윙거리는 소음을 생성해야 합니다.
8. 관심 뇌 영역이 완전히 절편화될 때까지 300μm 단위(또는 다른 선호하는 두께)로 조직을 계속 전진시키고 절단합니다. 절단 절차의 총 시간은 15분 미만이어야 합니다.

2. 최적화된 NMDG 보호 복구 절차

1. 초기 NMDG 회수 단계(중요 단계): 절편 절차가 완료되면 절단된 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 모든 슬라이스를 수집하고 150mL의 NMDG-HEPES aCSF로 채워진 예열된(34°C) 초기 회수 챔버로 옮깁니다. 모든 슬라이스를 짧게 연속으로 옮기고 모든 슬라이스가 회수 챔버로 이동하자마자 타이머를 시작합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
컴프레스톰 VF-200	정밀 기기	VF-200	진동 티슈 슬라이서(권장)
N-메틸-D-글루카민	시그마 알드리치	엠2004	aCSF 구성 성분
소금	시그마 알드리치	S3014	aCSF 구성 성분
염화칼륨	시그마 알드리치	P5405	aCSF 구성 성분
Sodium Phosphate 일염기성 이수화물	시그마 알드리치	71505	aCSF 구성 성분
중탄산나트륨	시그마 알드리치	S5761	aCSF 구성 성분
헤페스	시그마 알드리치	H4034	aCSF 구성 성분
포도당	시그마 알드리치	G7021	aCSF 구성 성분
아스코르브산나트륨	시그마 알드리치	A4034	aCSF 구성 성분
티오우레아	시그마 알드리치	T8656	aCSF 구성 성분
나트륨 피루브산	시그마 알드리치	P5280	aCSF 구성 성분
염화칼슘 이수화물	시그마 알드리치	C7902	aCSF 구성 성분
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트	시그마 알드리치	M1880	aCSF 구성 성분
구부러진 뭉툭한 집게	정밀 과학 도구	11065-07	뇌 해부 도구
미세 해부 가위(슈퍼컷)	정밀 과학 도구	14058-09	뇌 해부 도구
대형 헤비 듀티 가위 7 ''	정밀 과학 도구	14000-18	뇌 해부 도구
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