방법 논문

망막의 신경 조직의 장기간 배양을 위한 기술

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Cameron, M. A., et al. 전기생리학 및 칼슘 이미징을 위한 급성 신경 조직의 장기간 배양. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 망막의 신경 조직을 장기간 배양하는 방법을 보여줍니다. 망막을 함유한 안구컵은 생쥐의 눈에서 얻습니다. ILM(inner limiting membrane)을 효소로 소화하여 망막의 신경 세포를 노출시키고, 처리된 아이컵 또는 분리된 망막을 특수 인큐베이터로 옮겨 저온에서 장기간 배양합니다.

프로토콜

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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 망막 홀마운트 준비 및 내부 제한 멤브레인 제거

  1. 정상적인 실험실 조명 조건 또는 희미한 적색/적외선에서 망막 전체를 준비합니다.
  2. 경추 탈구로 동물을 안락사시키고 즉시 눈을 적출합니다. 오라 세라타를 따라 작게 자르고 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 포도당, 0.5 L-글루타민을 함유한 Ames 배지 또는 인공 뇌척수액(aCSF)에 넣고 실온(RT)에서 탄수화물(95% O2/5% CO2 혼합물, ~300 mOsm, pH 7.4)로 포화시킵니다.
  3. 작은 가위로 ora serrata를 따라 자르고 집게로 수정체와 유리체를 제거하여 각막, 수정체 및 유리체를 즉시 제거합니다. 배양 시스템에서 조직을 RT.
    로 놓습니다. 메모: 망막 조직은 15 - 16 °C로 천천히 온도를 낮춘 후 필요할 때까지 배양 시스템에서 >24 시간 동안 아이컵에 유지할 수 있습니다.
  4. ILM을 제거하려면 망막이 들어 있는 아이컵을 37°C에서 20분 동안 Earl's BSS(Balanced Salt Solution)에 30U/mL 파파인, 1mM L-시스틴, 0.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 0.005% 데옥시리보뉴클레아제(DNase)가 들어 있는 작은 유리병에 옮깁니다. 뚜껑을 통해 용액에 95% O2/5% CO2를 바르되 거품이 나지 않도록 합니다. 어린 동물(<6주)의 조직을 사용하는 경우 용액을 절반 농도로 희석하십시오.
    1. Earl's BSS에서 오보뮤코이드(10mg/mL) 및 소 혈청 알부민(BSA, 10mg/mL) 용액에 조직을 10분 동안 넣어 효소 분해를 중지합니다. 배양 시스템으로 옮기기 전에 CSF로 조직을 철저히 세척하고 온도를 15 - 16 °C로 낮추십시오.
  5. 필요할 때까지 아이컵의 망막 조직을 유지하십시오. 현미경으로 옮기려면 아이컵에서 망막을 분리하고 면도날로 4조각으로 자릅니다. 망막 전체가 필요한 경우 망막 주변을 네 번 작게 절개하여 평평하게 눕힐 수 있도록 합니다.
    메모: 이미징 실험의 경우, 배양 시스템으로 옮기기 전에 칼슘 염료를 로드하십시오(아래 참조).

2. 인큐베이터에서 조직 유지 관리

  1. pH 및 온도 측정을 위한 프로브가 들어 있는 메인 챔버에 조직을 놓습니다(그림 1A, B).
  2. 용액에 떠다니는 박테리아를 박멸하기 위해 메인 챔버에서 분리되고 1.1W 자외선 C(UVC) 광선(254nm, 5W/2P 살균기 UV 램프)에 노출된 두 번째 챔버(UVC 챔버, 앞서 설명한 대로 구축됨)를 통해 aCSF를 순환시킵니다(그림 1A). aCSF의 과도한 가열을 방지하기 위해 15-30분마다 15분에서 26분 사이에 다양한 시간에 켜지는 무작위 기능을 사용하여 프로그래밍 가능한 타이머를 통해 UVC 광 타이밍을 제어합니다.
  3. 이전에 보고된 대로 UVC 챔버의 유속을 12mL/분으로 설정합니다. UVC 챔버를 알루미늄 호일로 덮어 챔버 외부의 UVC 조명이 신경 조직을 손상시키는 것을 방지합니다.
    메모: 어둡게 적응된 망막 조직의 경우, 빛을 차단하기 위해 메인 챔버에 맞춤형 덮개를 적용합니다.
  4. 연동 펌프를 사용하여 용액(aCSF)을 두 개의 챔버를 통해 순환시키고 펠티에 열전 냉각판 냉각기를 사용하여 메인 챔버를 0 - 50 °C 범위의 원하는 온도로 냉각 또는 가열합니다. 최적의 조직 배양을 위해 장기 생존력을 위해 15 - 16 °C를 사용하십시오.

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결과

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그림 1. 조직 환경을 엄격하게 조절할 수 있는 배양 시스템입니다. A, 냉각 펠티에 플레이트, 메인 챔버, 연동 펌프 및 UVC 챔버로 구성된 인큐베이션 시스템의 개략도. B, aCSF의 입구 및 출구 지점과 탄소 입구, 온도 및 pH 프로브를 보여주는 메인 챔버의 측면 모습. 조직은 표시된 대로 메쉬에 배치됩니다. 모든 측정 프로브는 구조적 안정성을 위해 뚜껑에 부착되어 있습니다. C, aCSF 매개변수 배양 중 aCSF의 온도와 pH를 설명하는 스탬프. D, 측정 프로브의 장착 구멍을 보여주는 메인 챔버의 평면도.

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소금시그마 알드리치 VETECV800372
염화칼륨시그마 알드리치P9333
N-메틸-D-글루카민시그마 알드리치엠2004
D-포도당시그마 알드리치G5767
중탄산나트륨시그마 알드리치S6014
염화마그네슘시그마 알드리치M9272
염화칼슘시그마 알드리치223506
파파인 해리 시스템워 딩 턴LK003150
고정식 스테이지 정립 현미경올림푸스BX51WI
현미경 대물렌즈올림푸스XLUMPlanFLN 20배/1.00W20배
현미경 대물렌즈올림푸스LUMPlanFLN 60배/1.00w60배
브레인큐베이터Payo 사이언티픽BR26021976www.braincubator.com.au
Peltier-열전 냉각판 냉각기TE 기술CP-121
온도 조절기TE 기술TC-36-25 RS232
(영문) 년 시리즈 시리즈 시리즈

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태그

Ames

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