Isolation and Culturing of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

초록

출처: Kim, J. Y., et al. 마우스 callosal zone에서 성인 신경 줄기 세포의 분리 및 배양. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오는 쥐 뇌의 굵은 아래 영역에서 신경 줄기 세포를 분리하고 배양하는 과정을 보여줍니다. 그것은 조직을 해부하고, 효소 해리를 일으키고, 분화 인자로 배양하여 성숙한 신경 세포로 발달하는 것을 포함합니다.

프로토콜

1. 재료 및 배양 배지의 준비

1. SCZ(Subcallosal zone)의 해부 및 해리를 위해 뇌 매트릭스, 양날 면도날, 겸자를 알루미늄 호일로 감싼 후 고압멸균으로 살균합니다.
2. 쥐의 뇌 전체를 씻어내기 위해 차가운 PBS(인산염 완충 식염수) 완충액 50ml를 준비합니다.
3. 해부 현미경을 설치하고 뇌 해부(오토클레이브 가위 및 집게)와 SCZ 분리(주사기 1ml, 바늘 30G, 뇌 매트릭스 및 미세 집게)에 필요한 수술 도구를 준비합니다.
4. N2 매체의 준비 :
   1. 2% B27, 1% N2 보충제 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 F-12/DMEM(+L-글루타민, +중탄산나트륨) 배지를 준비합니다.
      참고: 성장 배지는 N2 배지 및 성장 인자(20ng/mL 정제 표피 성장 인자(EGF) 및 20ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF2))로 구성됩니다.
5. 조직 소화를 위해 분해 완충액(40 unit/ml papain, 2.4 unit/ml dispase II, PBS의 2% 페니실린-스트렙토마이신)을 준비합니다.
6. 코팅 플레이트 및 커버 슬립의 준비 :
   1. 폴리-L-오르니틴(PLO; 0.01%)과 라미닌(DH_2O에 용해된 10μg/ml)을 준비합니다. SCZ-aNSC(성체 신경 줄기세포)를 단층으로 유지하거나 면역염색을 위한 18mm 커버슬립으로 유지하기 위한 6웰 플레이트를 코팅하려면 4°C에서 하룻밤 동안 PLO로 배양합니다. 그런 다음 DH₂O로 3번 세탁합니다. 마지막 세탁 후 플레이트와 커버슬립을 건조시킵니다.
   2. 다음으로, 4°C에서 밤새 라미닌으로 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 DH₂O.
      로 3번 씻습니다. 주의: 세포 부착에 영향을 줄 수 있는 라미닌을 건조시키지 마십시오.
      참고: 코팅 용액은 3회 재사용할 수 있습니다.

2. 성인 SCZ의 격리 및 해리

1. 배양 준비 전에 뇌 매트릭스와 양날 면도기를 얼음 위에 놓습니다.
   참고: 뇌 매트릭스에 부착될 수 있으므로 뇌 매트릭스를 동결하지 마십시오.
2. CO₂ 질식 또는 자궁 경부 탈구로 생쥐(8주령)를 희생시킵니다.
   1. 70% 에탄올을 뿌린 후 날카로운 가위로 머리를 자릅니다. 머리를 움직이지 못하게 하려면 머리의 양쪽을 단단히 잡으십시오. 가위로 정중선에서 꼬리-주둥이 방향으로 피부를 자릅니다. 이것은 두개골에서 피부의 완전한 제거를 촉진합니다.
   2. 두개골의 꼬리 부분(람다에서 후방)을 먼저 제거한 다음 등쪽 정중선 위치에서 두개골과 뇌 사이의 겸자를 삽입합니다. 왼쪽(또는 오른쪽) 두정골을 잡고 조심스럽게 떼어냅니다. 다른 두정골을 제거하려면 이 절차를 반복합니다.
      참고: 시신경의 단절과 뇌수막의 제거는 두개골에서 뇌를 더 쉽게 분리할 수 있도록 합니다.
   3. 뇌를 차가운 PBS 완충액(25ml)으로 옮기고 두 번 헹구어 과도한 혈액을 제거합니다.
3. 뇌를 얼음 위의 뇌 매트릭스에 넣고 코로나 절단을 하여 1mm 두께의 조각을 얻습니다. 뇌의 뒤쪽에 위치한 SCZ 영역이 포함된 뇌 절편(1mm)을 35mm 플라스틱 페트리 접시에 담긴 차가운 PBS로 옮깁니다.
   주의: 관상 절편의 평행 평면을 얻으려면 뇌 열구가 뇌 기질의 정중선에 배치되어 있는지 확인하십시오. 섹션에서 불필요한 변형을 피하는 것이 중요합니다.
   메모: 브레그마 뒤쪽 2-3mm에서 뇌 절편을 얻습니다. 이를 통해 SVZ(심실하 영역)에서 SCZ를 분리할 수 있습니다.
4. 저배율의 해부 현미경으로 구부러진 30G 바늘로 피질과 해마의 백질 영역에서 SCZ를 미세 해부합니다 6,9. 그런 다음 SCZ 위의 피질 영역을 제거합니다. 슬라이스에서 절개된 SCZ 영역을 차가운 PBS가 없는 얼음 위에 35mm 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다.
   메모: 성숙한 뉴런을 포함하는 여분의 영역이 오염되면 aNSC 배양 조건에서 세포 사멸을 겪기 때문에 aNSC의 생존 및 신경구 형성에 영향을 미칠 수 있습니다.
5. 구부러진 30G 바늘을 사용하여 절개된 조직을 즉시 작은 조각으로 자릅니다.
   메모: SCZ 조직을 해부하는 데 더 오랜 시간이 필요한 경우 절단하기 전에 절개된 조직을 차가운 PBS에 담그십시오.
6. 잘게 잘린 조직을 1ml의 소화 완충액으로 다시 현탁시키고, 조직을 2ml의 소화 완충액이 들어 있는 15ml 튜브로 옮기고, 37°C 수조에서 30분 동안 배양합니다.
   메모: 10분마다 튜브를 흔들어 잘 섞습니다.

3. Subcallosal Zone 유래 성인 신경 줄기 세포 배양

1. 튜브를 가볍게 두드려 분해된 조직을 분리한 다음 145 x g에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 버리고 분해된 조직을 1mL의 예열된 N2 배지로 다시 현탁시켜 소화 완충액을 세척한 다음 P1000 피펫을 사용하여 샘플 용액을 최대 5회 부드럽게 피펫팅합니다.
   메모: 좁은 피펫 팁으로 과도하게 trituration하면 세포 생존력과 후속 성장이 감소할 수 있습니다.
2. 튜브를 145 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버린 후, 세포 펠릿을 N2 배지 1ml에 다시 현탁시킵니다.
3. 코팅되지 않은 6-well 플레이트에 1ml의 N2 배지를 준비하고 부유 세포 1ml를 추가하여 2ml의 최종 부피를 만듭니다.
4. 각 웰에 EGF(20ng/ml) 및 bFGF(20ng/ml)를 추가합니다. 6-well 배양 접시를 손으로 부드럽게 흔들어 첨가된 성장 인자를 도금된 세포와 혼합합니다. 6웰 플레이트를 37°C 및 5% CO₂ 인큐베이터에 보관하십시오.
5. EGF(20ng/ml) 및 bFGF(20ng/ml)를 8일 동안 매일 각 웰에 추가합니다. 3일마다 200μl의 N2 배지를 추가하여 배지의 약 2ml 부피를 유지합니다.

4. NSC를 신경구체 및 단층 배양으로 전달

하기

1. 신경구를 모아 새로운 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   참고: 단일 마우스 뇌의 SCZ에서 웰당 신경구(직경 >50μm)의 수는 64.3 ± 7.31로 SVZ(190.5 ± 6.33)보다 적었습니다.
2. 37°C 수조에서 0.5ml의 해리 완충액으로 신경구를 5분 동안 배양하여 신경구를 단일 세포로 해리합니다. 1차 신경구는 단일 세포로 해리될 수 있으며 신경구 또는 단층 배양으로 여러 통로에 걸쳐 유지될 수 있습니다.
   메모: SCZ-aNSC는 단층 배양 형식에서 >10회 계대될 수 있지만 신경구 배양 형식에서는 <5회 계대될 수 있기 때문에 SCZ-aNSC를 단층으로 확장하는 것이 신경권보다 우수합니다.
   주의: SCZ-aNSC는 강한 응집을 나타내며 단일 세포로 해리하기 어렵습니다. 따라서 신경구 배양 형식은 일상적인 세포 확장에 권장되지 않습니다.
3. P1000 피펫으로 샘플 용액을 5회 미만으로 부드럽게 피펫팅하고 145 x g에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 버리고 N2 배지 1ml로 신경구를 다시 현탁시킵니다.
   메모: 좁은 피펫 팁으로 과도하게 적정하면 세포 생존력과 후속 성장이 감소할 수 있습니다.
4. 세포를 계수하려면 세포 현탁액(10μl)과 0.4% 트리판 블루 용액을 1:1로 혼합한 다음 혈구계에서 살아있는 세포의 수를 계수합니다. 6-well plate를 PLO/laminin으로 코팅한 후 각 well.
   에 대해 2ml의 N2 배지로 셀을 2.5 x 105 cells/ml로 플레이트링합니다. 메모: 세포 밀도의 변화는 세포 상태와 분화 가능성에 영향을 미칠 수 있습니다.
5. 성장 인자(2ml, 20ng/ml)를 매일 5일 동안 처리하여 SCZ-aNSC를 유지한 후 계대배양합니다.

5. Subcallosal Zone 유래 성인 신경 줄기 세포의 분화

1. SCZ-aNSC의 분화를 위해 성장 인자(20ng/ml)가 있는 1ml N2에 1 x 105 cells/ml가 있는 PLO/Laminin 코팅된 18mm 커버슬립에 aNSC를 플레이트합니다.
2. 다음날, 세포가 커버슬립에 단단히 부착되면 성장 인자를 제거하기 위해 성장 배지를 N2와 교환합니다.
3. 6일 후, 분화된 세포를 PBS 1ml로 세척하여 세포 파편을 제거하고 면역염색을 위해 고정합니다.
   참고: BrdU는 증식하는 세포의 새로 합성된 DNA에 통합될 수 있습니다. 그러므로, 원하는 경우, 세포를 고정하기 전에 BrdU(10 μg/ml)를 살아있는 세포에 첨가할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12	지브코	제11320-033	L-글루타민, 중탄산나트륨
펜/연쇄상구균	인비트로젠	15140-122
N2 보충제	지브코	제17502-048
B27 보충제	지브코	제17504-044
bFGF	R&D	233-FB
증권 시세	지브코	PHG0313
PBS(10배)	바이오솔루션	BP007ᅡ	1X 희석
HBSS (하이브에스)	지브코	제14175-095
디스플레이 II	로슈	TEL.04-942-078-001
파파인	워 딩 턴	3126
아카쿠타아제	정보통신기술(ICT)	AT-104
가는 집게	WPI (영어)	555229F
가위	스토츠	E3321-C
뇌 매트릭스 (1mm)	RWD	68707
양날 면도기	도르코	세인트-300
30 게이지 바늘	성심	N1300
15 ml 튜브	증권 시세	50015
튜브 50ml	증권 시세	50050
35mm 접시	증권 시세	10035	페트리쉬
100mm 접시	증권 시세	10090	페트리쉬
커버 슬립(18mm)	데크레이저	111580
12 웰 디쉬	증권 시세	32012	비코팅
6 웰 접시	증권 시세	32006	비코팅
PLO (폴리에틸렌)	시그마	P4957	0.01%
라미닌	지브코	23017-015	10 밀리그램 / 밀리람베르트
네스틴	밀리포어	메이브353	마우스 (1:1000)
브르두	아브캠	AB6326	쥐 (1:500)
페니실린
스트렙토마이신
해부 현미경
원심 분리기
P1000 피펫
수조
CO2 인큐베이터
트리판 블루
혈구분석기

호 년 호 호 표시기 호 년 표시기 년 표시기 년 표시기 년 표시기 년 년 표시기 년 표시기 년 년