1. 인간 뇌실 주위 내피 세포의 배양 및 저장
- 37°C 및 5% CO2에서 심실 주위 내피 세포 배지(50ng/mL 혈관 내피 성장 인자 A[VEGF-A], 100ng/mL 섬유아세포 성장 인자 2[FGF2] 및 5μM 감마 아미노낙산[GABA]를 포함하는 E6 배지)에서 기저막 매트릭스 코팅된 기저막 내피 세포(재료 표 참조) 6웰 플레이트에 인간 뇌실 주위 내피 세포를 유지합니다. 격일로 매체를 변경합니다.
- 기저막 매트릭스를 4°C에서 해동하고 Dulbecco의 modified Eagle 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12) 배지에 희석하여 1:100 용액을 만듭니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 매트릭스 용액 1mL를 코팅합니다. 사용하기 전에 최소 1시간 동안 37°C에서 플레이트를 배양하십시오.
- 인간의 뇌실 주위 내피 세포가 80%-90%의 포화도에 도달하도록 합니다. 우물에서 배지를 흡인합니다. 웰당 1mL의 멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 웰을 한 번 세척합니다.
- 웰당 1mL의 세포 해리 용액(재료 표 참조)을 추가하여 세포를 분리합니다. 37 ° C에서 5 분 동안 배양하십시오. 5분 후, 1mL의 뇌실 주위 내피 세포 배지를 추가합니다. 세포 용액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
메모: 여기서는 세포 해리를 위해 Accutase를 사용하며, 섹션 3 및 4의 TrypLE와 대조적으로 사용합니다.
- 실온에서 5분 동안 500 x g의 원심분리 세포를 원심분리하고, 상층액을 흡인하고 세포 펠렛을 1mL의 뇌실 주위 내피 세포 배지에 재현탁합니다.
- trypan blue exclusion 방법을 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다. 1.2 x 105 cells/cm2의 밀도로 새로운 매트릭스 코팅된 플레이트의 종자 세포. 37 ° C 및 5 % CO2에서 배양하십시오.
- 냉동 배지(90% 뇌실 주위 내피 세포 배지 및 10% 디메틸 설폭사이드[DMSO])에 동결 보존하여 인간 뇌실 주위 내피 세포를 저장합니다.
- 위의 1.3 및 1.4 단계에 따라 셀을 해리하고 수집합니다. 트리판 블루 배제 방법(trypan blue exclusion method)을 사용하여 용액의 세포를 세웁니다.
- 실온에서 500 x g의 원심분리 셀. 상층액을 흡인하고 세포 펠렛을 5 x 106 cells/mL의 동결 매체에서 재현탁합니다.
- cryovial당 1mL의 동결 배지와 세포를 분주합니다. 바이알을 이소프로판올이 채워진 챔버에 넣고 -80°C에서 1°C/분으로 밤새 냉각합니다. 장기 보관을 위해 다음날 바이알을 액체 질소 탱크로 옮깁니다.
2. 분석을 위한 인간 뇌실 주위 내피 세포의 준비
- 인간 뇌실 주위 내피 세포가 70%-80% 포화도에 도달하도록 합니다.
- 위에서 설명한 대로 1.3-1.5단계에 따라 세포를 해리합니다. trypan blue exclusion 방법을 사용하여 셀 수를 계산합니다.
3. 분석을 위한 Human GABAergic Interneurons 준비
참고: 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 GABAergic 중간뉴런 및 신경 배지는 상업적으로 구매되었습니다(재료 표 참조). 뉴런은 제조업체가 개발한 프로토콜에 따라 인간 섬유아세포 유래 iPSC 라인을 분화하여 생성됩니다. 세포는 제조업체의 프로토콜에 따라 해동 및 배양되었습니다.
- 인간 GABAergic interneuron을 해동하고 12-well plate에서 2주 동안 70%-80%의 포화도까지 배양합니다.
- 분석 당일, 따뜻한 세포 해리 용액(재료 표 참조)과 사용 전 37°C에서 10분 동안 뉴런 배지 분취액을 제공합니다.
- 세포를 포함하는 각 웰에서 배지를 흡인합니다. 웰당 1mL의 멸균 1x PBS로 셀을 세척합니다.
- 웰당 0.5mL의 예열된 해리 용액을 추가하여 세포를 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 웰당 1mL의 뉴런 배지를 추가합니다. 세포 용액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포 덩어리를 해리하기 위해 부드럽게 분쇄합니다.
- 실온에서 5분 동안 380 x g의 세포를 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 1mL의 뉴런 배지에 세포 펠렛을 재현탁합니다. trypan blue exclusion 방법을 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다.
4. 분석을 위한 대조군 인간 내피 세포의 준비
참고: 대조군 인간 iPSC 유래 내피 세포 및 내피 세포 배지가 상업적으로 구매되었습니다(재료 표). 이러한 내피 세포는 제조업체가 개발한 프로토콜에 따라 인간 섬유아세포 유래 iPSC 라인을 내피 운명으로 분화하여 생성됩니다. 세포를 해동하고 제조업체의 프로토콜에 따라 Fibronectin 기질에서 배양했습니다. 피브로넥틴 코팅 플레이트는 제조업체의 프로토콜에 따라 제조되었습니다.
- 해동은 인간 내피 세포를 제어하고 6웰 플레이트에서 80%-90%의 포화도까지 배양합니다.
- 분석 당일, 따뜻한 세포 해리 용액(재료 표 참조)과 내피 배지의 분취액을 37°C에서 10분 동안 사용 전에 사용합니다.
- 세포를 포함하는 각 웰에서 배지를 흡입합니다. 웰당 1mL의 멸균 1x PBS로 셀을 세척합니다.
- 웰당 0.5mL의 예열된 해리 용액을 추가하여 세포를 분리합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다. 웰당 1mL의 내피 세포 배지를 추가하여 해리 용액을 중화합니다. 세포 용액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 실온에서 5분 동안 200 x g의 원심분리 셀. 상층액을 흡인하고 세포 펠렛을 1mL의 내피 세포 배지에 재현탁합니다. trypan blue exclusion 방법을 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다.
5. One-well Culture 인서트 준비
- 1mg/mL 라미닌 용액을 실온에서 또는 4°C에서 밤새 해동합니다.
- 35mm 접시에 0.01% 폴리-L-오르니틴 용액(접시당 1mL)을 적당량 코팅합니다. 접시를 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
- 사용 직전에 1mg/mL 라미닌 용액을 멸균수에 1:300으로 최종 농도 3.3μg/mL로 희석합니다.
- 각 접시에서 폴리-L-오르니틴을 완전히 흡인합니다. 각 접시를 멸균수로 3번 철저히 헹구고 폴리-L-오르니틴 유발 세포 독성을 피하기 위해 완전히 흡인합니다.
- 각 접시에 3.3μg/mL 라미닌 용액 1mL를 추가하고 37°C에서 하룻밤 또는 최소 1시간 동안 배양합니다. 사용 직전에 접시에서 라미닌 용액을 제거하십시오.
메모: 또는 라미닌 함유 접시를 4°C에 보관하십시오. 사용하기 전에 37°C 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 평형화합니다.
- 멸균 블레이드를 사용하여 2웰 실리콘 배양 인서트(그림 1A)의 한 웰의 3면을 절단하여 1웰 인서트(그림 1B)를 생성합니다.
메모: 절단하는 동안 2웰 인서트를 원래 포장 표면에 단단히 부착하여 부드러운 절단을 보장하고 인서트의 접착력을 보호하십시오.
- 접시에서 라미닌 용액을 흡입하십시오 .
메모: 라미닌 배양 후 멸균 PBS 또는 물로 식기를 세척하지 마십시오. 젖은 표면은 배양 인서트의 단단한 접착을 방해합니다.
- 멸균 핀셋으로 원웰 인서트를 제거하고 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅 접시의 중앙에 놓습니다. 인서트의 가장자리를 따라 눌러 접시 표면에 고정합니다.
- 접시를 조심스럽게 거꾸로 뒤집어 인서트가 단단히 부착되었는지 확인하십시오.
- 접시를 거꾸로 유지하고 초미세 팁이 있는 영구적인 검은색 마커를 사용하여 인서트 컴파트먼트의 경계를 표시합니다(그림 1C).
6. 공동 배양 이주 분석
- 70 μL의 공동 배양 배지(GABA가 없는 50% 뇌실 주위 유지 배지 및 50% 뉴런 배지 50%)에 3 x 104 GABAergic interneurons 및 3 x 104 human periventricular endothelial cells를 공동 현탁합니다. 이 세포 용액을 one-well 삽입 구획 내부에 파종합니다. 그런 식기를 적당량 준비한다.
메모: GABA는 이동에 대한 외인성 GABA의 영향을 배제하기 위해 공동 배양 배지에 첨가되지 않았습니다.
- 현미경으로 검사하여 삽입 구획에서 세포가 누출되지 않는지 확인하십시오.
- 코팅이 건조되는 것을 방지하기 위해 접시 측면을 따라 1mL의 공동 배양 배지를 천천히 추가합니다.
메모: 인서트가 방해받지 않도록 접시 가장자리를 따라 매체를 천천히 추가합니다.
- 첫 번째 대조군으로, 3 x 104 human GABAergic interneuron은 one-well insert당 70μL의 공동 배양 배지에만 seed합니다. 적절한 수의 요리를 준비하십시오.
- 두 번째 대조군으로, 3 x 104 GABAergic human interneuron을 3 x 104와 함께 1-well insert당 70 μL의 공동 배양 배지에서 인간 내피 세포를 공동 시딩합니다. 적당량의 요리를 준비합니다.
- 37 ° C 및 5 % CO2에서 24 시간 동안 접시를 배양합니다. 24시간 배양 후 현미경으로 세포가 제대로 부착되었는지, 누출이 없는지 확인합니다.
- 파종 48시간 후 멸균 핀셋을 사용하여 인서트를 부드럽게 제거합니다. 현미경 아래를 확인하여 세포층이 방해받지 않았는지 확인합니다(0일차).
- 배지를 제거하고 새로운 공동 배양 배지 1mL를 추가합니다.
메모: 0일차 이미지를 획득하기 위해 적절한 수의 요리를 따로 마련합니다.
- 37 ° C 및 5 % CO2에서 5 일 동안 세포를 배양합니다.
