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1. MEA 준비
참고: MEA는 유리 기판, 미세 가공 금속 전극 및 SU-8 폴리머 절연층으로 구성됩니다. 이 연구의 목적을 위해 상업적으로 이용 가능한 MEA는 맞춤형 전극 어레이 레이아웃과 함께 주문되었습니다(그림 1 A&B). 68개의 전극은 전극, 전기 리드 및 절연체가 없는 300μm 너비의 홈에 의해 두 영역으로 분할된 직사각형 그리드에 배열되어 있습니다. 각 전극의 크기는 40 x 40μm이며 중심에서 중심까지 200μm 떨어져 있습니다. 4개의 대형 접지 전극이 기록 부위 주변에 배치됩니다. 시중에서 판매되는 다른 표준 MEA와 크기(21mm x 21mm)가 다르며 고정된 기록 챔버가 없습니다.
- 소독을 위해 MEA를 100% 에탄올(2x), 70% 에탄올(1x) 및 증류수(2x)로 각각 30초 이상 헹굽니다. 말리십시오. 깨끗한 유리 페트리 접시(150mm x 25mm)에 10 - 12 MEA를 넣고 뚜껑을 닫습니다.
- 120°C에서 20분 동안 MEA를 오토클레이브합니다. RT에 보관하십시오.
- MEA에 대한 코팅 용액(재료 목록 참조)을 준비하고 -20°C에서 부분 표본을 보관합니다.
- 각 MEA를 개별 멸균 페트리 접시(35mm x 10mm)에 넣습니다.
- 냉각된 피펫을 사용하여 전극 위에 150μl의 냉각 코팅 용액을 놓고 페트리 접시의 뚜껑을 닫습니다. 약 10분 후 전극 상단에 기포가 있는지 확인하고 필요한 경우 고무로 덮인 주걱으로 부드럽게 제거합니다. 실온(RT)에서 1시간 동안 그대로 두십시오.
- 코팅 용액 잔류물을 흡인하고 태아 및 배아 뉴런에 최적화된 배지로 1배, 증류수 멸균수로 2배로 세척합니다. MEA를 다음 날까지 사용하지 않을 경우 인큐베이터에서 37°C의 증류수 멸균수에 밤새 보관(O/N)합니다. 그렇지 않으면 RT에서 직접 건조시키십시오.
2. 유기형 배양의 준비 및 성장에 필요한 성분
- 칼슘이 없는 세척 용액을 준비합니다(재료 목록 참조).
- 세척 용액에 닭 플라즈마를 재구성하고(1:1, 부드럽게 흔들기, 거품 형성 방지), 3,000 x g에서 약 20분 동안 원심분리한 다음 투명한 내용물을 멸균 튜브에 디캔팅합니다. 200 μl를 cryotubes에 분취하고 -20 °C에서 보관하십시오.
- 소 혈장(200 U/ml) 및 멸균 필터(0.2 μm 공극 필터)를 사용하여 트롬빈을 적절하게 재구성합니다. 200 μl를 crytotubes에 분취하고 -20 °C에서 보관하십시오.
- 30 배양의 경우 100ml의 영양 배지를 준비합니다 (재료 목록 참조).
3. 척수 조직 절제
참고: 절차는 배아의 수에 따라 약 25 - 35개의 공동 배양을 위해 척수 절편을 산출하고 멸균 조건에서 층류 후드 내부에 준비됩니다.
- 근육 주사로 모체 동물에게 치사량의 펜토바르비탈(0.4ml)을 도포합니다. 페달 철수 반사를 확인하여 깊은 마취를 확인하십시오. 배아 14일(E14) 쥐 배아를 제왕절개로 분만하고 참수로 희생합니다.
- 배아의 시체를 멸균되고 냉장된 세척 용액으로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다.
- 뒷다리 위에 메스로 메스를 한 번 완전히 가로 자르고 앞다리 위에 메스를 한 번 더 하고 몸에서 팔다리를 제거합니다. 다음으로, 척수를 포함하는 뒤쪽 조각에서 내장을 분리하기 위해 정면 평면을 절개합니다.
- 슬라이싱의 경우, 척수가 들어있는 뒤쪽 조각을 마운팅 디스크에 한 번에 하나씩 옮기고 조직 초퍼로 225 - 250 μm 두께로 자릅니다. 다진 조직에 세척액 한 방울을 떨어뜨리고 멸균, 냉장, 세척 용액으로 채워진 35mm x 10mm 페트리 접시에 주걱으로 슬라이스를 옮깁니다.
- 각 조각에 대해 척수를 남아 있는 조직에서 분리하여 분리합니다. 등쪽 뿌리 신경절은 붙어 둡니다.
- 슬라이스를 4 °C에서 1시간 동안 그대로 두십시오.
4. MEA에 척수 조직 슬라이스 장착
- 인큐베이터에서 멸균 영양 배지를 예열합니다(37°C, 산소 공급을 위해 뚜껑을 가볍게 풀음).
- 전극 어레이에 초점이 맞춰진 실체 현미경 아래 페트리 접시의 RT에서 고무로 덮인 팁이 있는 멸균 핀셋으로 MEA를 배치합니다. 6μl의 치킨 플라즈마 방울을 깨끗하고 먼지가 없는 멸균 전극 어레이의 중앙에 놓습니다. 작은 주걱을 사용하여 복부 측면이 서로 마주 보도록 두 개의 척수 부분을 혈장 방울에 조심스럽게 밀어 넣습니다. 주걱으로 전극을 만지지 마십시오.
- 닭 혈장 방울 주위에 8μl의 트롬빈을 추가합니다. 트롬빈 피펫 팁을 사용하여 치킨 플라즈마/트롬빈 혼합물을 조심스럽게 섞어 두 조각 주위에 펴 바릅니다. 다시 말하지만, 부서지기 쉬운 전극 어레이를 직접 만지지 마십시오. 응고 직전에 과도한 닭 혈장/트롬빈을 흡입하십시오.
- MEA/배양 어셈블리가 37°C의 인큐베이터 내부의 가습 챔버에서 약 1시간 동안 방치되는 동안 높은 습도를 유지하기 위해 페트리 접시의 뚜껑을 닫습니다.
- 배양 챔버에 10μl의 영양 배지를 조심스럽게 추가하고 페트리 접시를 덮고 약 30분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- 멸균 및 고무로 덮인 팁이 있는 각 MEA/배양 어셈블리를 롤러 튜브에 넣고 영양 배지 3ml를 추가한 다음 뚜껑을 단단히 닫습니다. 롤러 튜브를 롤러 드럼에 넣고 37 ° C에서 5 % CO2 함유 분위기의 인큐베이터에서 2 - 2 rpm으로 회전합니다.
- 체외(DIV) 7일 후 영양 배지의 절반을 교체하고 그 후에는 일주일에 1-2회 교체하십시오.
5. 기계적 병변
- 롤러 튜브에서 멸균 및 고무로 덮인 팁이 있는 MEA/배양 어셈블리를 꺼내 조직에 초점을 맞춘 실체 현미경 아래 영양 매체가 없는 페트리 접시에 넣습니다. 두 조각이 융합되어 있는지 육안으로 확인합니다.
- MEA에 끝이 고무로 덮인 핀셋을 놓아 MEA/배양 어셈블리를 안정적으로 잡습니다.
- 메스 날을 조직 조각에 가까운 MEA의 홈에 놓습니다. 메스를 약간 수평으로 잡습니다.
- 메스 손잡이를 들어 올리되 메스 날이 바닥에서 끝까지 "굴러가서" 홈을 덮고 있는 조직을 절단하는 방식으로 메스 날이 MEA의 홈에 머물도록 합니다.
- 필요한 경우 25G 바늘 끝으로 잔여 조직 연결을 심하게 합니다. 홈 안에서만 작업하고 부드러운 가장자리를 만지지 마십시오.
- MEA/배양 어셈블리를 롤러 튜브에 다시 넣습니다. 배양액에 3ml의 신선한 영양 배지를 제공하고 인큐베이터의 롤러 드럼에 다시 넣습니다.
6. 자발적 활동의 전기생리학적 기록
- 선택한 DIV 수 이후 두 척수 절편 간의 기능적 재생을 조사하려면 현미경의 기록 챔버에 MEA/배양 어셈블리를 장착하고 약 500μl의 세포 외 용액을 적용합니다(재료 목록 참조).
- 시스템이 안정화될 수 있도록 첫 번째 녹음 전에 10분 정도 기다립니다.
- RT에서 MEA의 각 활동 감지 전극에서 약 10분 동안 기본 자발적 활성을 2회 기록합니다.
- 안정적인 세포 외 상태를 보장하려면 모든 녹음 세션 후에 세포 외 용액을 교환하십시오.
