Single-Use Bioreactors를 사용하여 유도 만능 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오가노이드 생성

초록

출처: Silva, T.P., et al. 인간 만능 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역염색에 의한 특성화. J. Vis. 특급. (2020년)

이 동영상은 일회용 3D 바이오리액터를 사용하여 유도만능줄기세포(iPSC)에서 성숙한 소뇌 오가노이드를 생성하는 기술을 보여줍니다. 바이오리액터는 iPSC 응집체 형성을 촉진한 다음, 성장 인자와 케모카인이 풍부한 일련의 배양 배지로 처리하여 iPSC 응집체가 성숙한 소뇌 오가노이드로 분화되도록 유도합니다. 그 후, 오가노이드를 수확하고 추가 분석을 위해 동결 보존합니다.

프로토콜

1. 생물반응기에서 human iPSCs 파종(seeding

)

1. 10μM의 ROCK 억제제 Y-27632(ROCKi)가 보충된 mTeSR1에서 단층으로 성장한 iPSC를 배양합니다. 6-well 조직 배양 플레이트의 각 웰에 1mL의 보충 배지를 추가하고 37°C, 95% 습도 및 5% CO₂.
   에서 1시간 동안 배양합니다. 메모: ROCKi는 세포사멸(apoptosis)로부터 해리된 iPSC를 보호하는 데 사용됩니다.
2. 배양 1시간 후, 각 웰에서 사용한 배지를 흡인하고 웰당 1×PBS 1mL로 1x를 세척합니다.
3. 6-well 플레이트의 각 well에 1mL의 세포 분리 배지(재료 표 참조)를 추가하고 세포가 부드럽게 흔들어 well에서 쉽게 분리될 때까지 37°C에서 7분 동안 배양합니다.
4. 세포가 분리되어 단일 세포로 해리될 때까지 P1000 마이크로피펫으로 세포 분리 배지를 위아래로 피펫팅합니다. 각 웰에 2mL의 완전한 세포 배양 배지를 추가하여 효소 분해를 비활성화하고 세포를 멸균 원뿔형 튜브에 부드럽게 피펫팅합니다.
5. 210 × g에서 3분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다.
6. 세포 펠릿을 배양 배지(즉, 10μM의 ROCKi가 보충된 mTeSR1)에 재현탁하고 트리판 블루 염료를 사용하여 혈구계로 iPSC를 계수합니다.
7. 250,000 cells/mL의 최종 세포 밀도에서 10μM의 ROCKi가 보충된 60mL의 mTeSR1을 사용하여 생물반응기(최대 부피 100mL)에서 15 ×^{10 6}개의 단일 세포를 시드합니다.
8. 인큐베이터에 배치된 범용 기본 장치에 iPSC가 들어 있는 용기를 37°C, 95% 습도 및 5% CO₂.
   에서 삽입합니다. 메모: 바이오리액터 교반은 iPSC 응집을 촉진하기 위해 범용 기본 장치 제어를 27rpm으로 설정하여 24시간 동안 유지됩니다.

2. 소뇌 오가노이드에서 인간 iPSC 유래 응집체의 분화 및 성숙

1. 단일 세포 파종일을 0일로 정의합니다.
2. 1일차에 혈청학 피펫을 사용하여 iPSC 응집체 검체 1mL를 수집합니다. 샘플을 채취하기 전에 응집체를 포함하는 생물반응기와 함께 범용 기본 장치를 멸균 흐름으로 배치하여 이전과 같이 생물반응기를 교반 상태로 유지합니다. 세포 현탁액을 초저 부착물 24웰 플레이트에 플레이트합니다. iPSC 파생 응집체가 형성되었는지 확인합니다.
3. 40x 또는 100x의 총 배율을 사용하여 광학 현미경으로 이미지를 획득하여 골재 직경을 측정합니다.
4. FIJI 소프트웨어를 사용하여 각 이미지의 응집체 면적을 측정합니다.
   1. "분석 | 메뉴 표시줄에서 Measurements(측정)"를 설정하고 "Area(영역)" 및 "OK(확인)"를 클릭합니다.
   2. "파일 | 메뉴 표시줄에서 열기"를 클릭하여 저장된 이미지 파일을 엽니다. 도구 모음에 표시된 선 선택 도구를 선택하고 이미지에 표시된 축척 막대 위에 직선을 만듭니다. "분석 | 메뉴 표시줄에서 배율 설정"을 선택합니다.
   3. "Known distance"에서 이미지의 축척 막대 범위를 μm 단위로 추가합니다. "길이 단위"를 μm로 정의합니다. "Global"을 클릭하여 설정을 유지하고 "OK"를 클릭합니다. 도구 모음에서 Oval Selection을 선택합니다.
   4. 각 골재에 대해 타원형 도구로 영역을 묘사합니다. "분석 | 측정". 측정된 면적을 기준으로 직경을 계산하고, 골재가
      를 사용하여 대략 구형임을 고려합니다.
      A를 집계의 영역으로 사용합니다.
5. 응집체의 평균 직경이 100μm인 경우 사용한 배지의 80%를 ROCKi가 없는 새 mTeSR1로 교체합니다. 응집체의 직경이 200–250 μm에 도달하면 사용한 모든 배지를 gfCDM으로 교체하여(표 1) 오가노이드가 생물반응기 바닥에 침전되도록 합니다.
   메모: 평균 골재 직경이 350μm를 초과하는 경우 차별화 프로토콜을 시작하지 마십시오. 단일 세포의 파딩을 반복합니다. 일반적으로 골재가 평균 직경 100μm에 도달하는 데 약 1일이 걸립니다.
6. 인큐베이터에 배치된 범용 기본 장치에 응집체를 포함하는 생물반응기를 37°C, 95% 습도 및 5% CO₂에서 삽입합니다.
7. 생물반응기 교반을 25rpm으로 줄입니다.
8. 2일차에 2.2, 2.3, 2.4단계를 반복하여 골재 직경을 평가합니다. 60mL의 gfCDM 분화 배지에 30μL의 FGF2(최종 농도, 50ng/mL) 및 60μL의 SB431542(최종 농도, 10μM)를 추가합니다(표 1). 바이오리액터에서 사용한 모든 배지를 보충된 gfCDM으로 교체합니다. 2.6.
   단계를 반복합니다. 참고: SB431542는 중배엽 분화를 억제하여 신경 분화를 유도하는 데 중요합니다. FGF2는 신경 상피 조직의 꼬리 형성을 촉진하는 데 사용됩니다.
9. 5일차에 2.2, 2.3, 2.4 및 2.8.
   단계를 반복합니다. 메모: 집계 크기는 차별화 프로토콜 중에 증가해야 합니다. 그러나 직경은 분화가 시작될 때만 중요한데, 이 매개변수는 분화의 효율성에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다.
10. 7일차에 2.2, 2.3, 2.4단계를 반복합니다. FGF2 및 SB431542를 2/3로 희석: 20μL의 FGF2와 40μL의 SB431542 - 60mL의 gfCDM 분화 배지를 추가합니다. 바이오리액터에서 사용한 모든 배지를 보충된 gfCDM으로 교체합니다. 2.6단계를 반복하고 생물반응기 교반을 30rpm으로 증가시킵니다.
11. 14일째에 2.2, 2.3 및 2.4단계를 반복합니다. 60μL의 FGF19(최종 농도, 100ng/mL)를 60mL의 gfCDM 분화 배지에 추가합니다. 바이오리액터에서 사용한 모든 배지를 FGF19가 보충된 gfCDM으로 교체합니다. 2.6.
    단계를 반복합니다. 메모: FGF19는 중뇌 후뇌 구조의 분극을 촉진하는 데 사용됩니다.
12. 18일째에 2.2, 2.3, 2.4 및 2.11단계를 반복합니다.
13. 21일째에 2.2, 2.3, 2.4단계를 반복합니다. 생물반응기에서 사용한 모든 배지를 완전한 neurobasal 배지로 교체합니다(표 1). 2.6.
    단계를 반복합니다. 메모: Neurobasal medium은 오가노이드 내의 neuronal cell population을 유지하는 데 사용되는 기저 배지입니다.
14. 28일째에 2.2, 2.3, 2.4단계를 반복합니다. 180μL의 SDF1(최종 농도, 300ng/mL)을 60mL의 완전한 신경기저 배지에 추가합니다. 생물반응기에서 사용한 모든 배지를 SDF1이 보충된 완전한 neurobasal 배지로 교체합니다. 2.6.
    단계를 반복합니다. 메모: SDF1은 별개의 세포층의 조직을 용이하게 하는 데 사용됩니다.
15. 35일째에 2.2, 2.3 및 2.4단계를 반복합니다. 바이오리액터에서 사용한 모든 배지를 완전한 BrainPhys 배지로 교체합니다(표 1). 2.6.
    단계를 반복합니다. 메모: BrainPhys는 시냅스 활성 뉴런을 지원하는 뉴런 매개체입니다.
16. 분화 90일째까지 3일마다 총 부피의 1/3을 완전한 BrainPhys 배지로 교체합니다.

표 1: 재고 용액 및 매체 준비. 여기에는 iPSC 유지 및 분화 프로토콜을 위한 배지를 준비하는 데 사용되는 모든 구성 요소와 부피, 성장 인자 및 소분자의 저장 용액이 나열되어 있습니다. 재고 용액의 경우 모든 재고 농도 및 재구성을 위한 프로토콜이 나열되어 있습니다.

합니다. .

미디어 준비	mTeSR1 최종 용량: 500 mL	1. mTeSR1 5× 보충제를 실온(RT) 또는 4°C에서 하룻밤 동안 해동하고 기초 배지 와 혼합합니다. 2. 전체 mTeSR1 배지를 4°C에서 최대 2주 동안 보관하거나 40mL 부분 표본을 준비하고 -20°C 에서 보관합니다. 3. 사용 전 RT에서 완전한 mTeSR1을 예열
	gfCDM(성장 인자 없는 화학적으로 규명된 매체) 최종 용량: 60mL	30mL Ham's F12 30mL IMDM 600μL 화학적으로 정의된 지질 농축물(1% v/v) 2.4μL 모노티오글리세롤(450μM) 30μL 아포-트랜스페린(물 중 30mg/mL의 원액, 최종 농도: 15μg/mL) 300mg 결정화 정제 BSA(5mg/mL) 42μL 인슐린(10mg/mL의 스톡 농도, 최종 농도: 7 μg/mL) 300 μL P/S (0.5% v/v, 50 U/ml 페니실린/50 μg/ml 스트렙토마이신)
	Neurobasal 최종 용량: 60mL	60mL의 Neurobasal 배지 600μL N2 보충제, 600μL 글루타맥스 I 300μL P/S(0.5% V/v).
	BrainPhys 완료 최종 용량: 60mL	BrainPhys 1.2mL NeuroCult SM1 뉴런 보충제 600mL N2 보충제 12μL BDNF(최종 농도: 20ng/mL) 12μL GDNF(최종 농도: 20ng/mL) 300μL Dibutyryl-cAMP(스톡 농도: 물 내 100mg/mL, 최종 농도: 1mM) 42μL 아스코르브산(스톡 농도: 물 내 50μg/mL, 최종 농도 : 200 nM)
성장 인자와 작은 분자의 재고 솔루션	염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF/FGF2) 재고 농도: 100 μg/mL	1. 10 mg/mL 의 농도에서 5 mM Tris, pH 7.6으로 재구성합니다. 2. PBS (v/v)에 0.1% BSA로 최종 재고 농도 100 μg/mL로 희석
	기질 세포 유래 인자 1 (SDF1) 재고 농도: 100 μg/mL	1. 10 mg/mL 의 농도로 물에서 재구성하십시오. 2. PBS에서 0.1 % BSA (v / v)로 100 μg / mL의 최종 재고 농도로 희석한다.
	뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF) 재고 농도 : 100 μg / mL<
	신경교세포 유래 신경영양인자(GDNF) 재고 농도: 100 μg/mL
	섬유아세포 성장 인자 19 (FGF19) 재고 농도: 100 μg/mL	1. 5mM 인산나트륨, pH 7.4, 10mg/mL 의 농도로 재구성합니다. 2. PBS (v/v)에 0.1% BSA로 최종 재고 농도 100 μg/mL로 희석
	ROCK 억제제 Y-27632 재고 농도 : 10mM	10mM의 농도로 DMSO에서 재구성합니다.
	SB431542 재고 농도 : 10mM
	인슐린 재고 농도: 10 mg/mL	1. 300μL의 10mM NaOH 에 10mg의 인슐린을 재구성합니다. 2. 용액이 투명해질 때까지 1M NaOH를 조심스럽게 첨가합니다 3. 멸균 물을 1mL까지 채웁니다

표 2: 동결 절제 및 면역 염색을 위한 오가노이드 준비 솔루션. 냉동 절편 및 면역 염색을 위한 오가노이드 준비에 사용되는 용액을 준비하는 데 사용되는 모든 구성 요소와 부피가 나열되어 있습니다.

젤라틴/자당 최종 농도 : 7.5 % / 15 % w / w

1. 멸균 Schott 유리 병에 자당 15g과 젤라틴 7.5g의 무게를 달고 잘 섞습니다 2. PBS 1×를 65 °C 에서 예열 3. 예열 된 PBS 100g의 최종 중량에 1×를 넣고 잘 섞습니다 4. Schott 유리병을 65°C의 가열판에 넣고 젤라틴이 녹을 때까지 흔듭니다 5. 용액이 안정화 될 때까지 37 ° C에서 배양하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BrainPhys 뉴런 미디엄 N2-A & SM1 키트	5793 - 500mL	줄기세포 과학
화학적으로 정의된 지질 농축액	11905031	써모피셔
결정화 정제 BSA	5470	시그마
DMEM-F12	제32500-035	써모피셔
소 태아 세럼	A3840001	써모피셔
소 가죽에서 추출한 젤라틴	G9391	시그마
글루타맥스 I	제10566-016	써모피셔
디부티릴 캠프	사우스캐롤라이나-201567B -500mg	프릴라보
햄스 F12	21765029	써모피셔
인간 에피솜 iPSC 라인	A18945	써모피셔	아이PSC6.2
국제경영시스템(IMDM	12440046	써모피셔
인슐린	91077씨	시그마
iPS DF6-9-9T.B		위셀
이소펜탄	PHR1661-2ML	시그마
L-아스코르브산	A-92902	시그마
마트리겔	제354230	코 닝	기저막 매트릭스
모노티오글리세롤	M6154	시그마
엠테SR1	85850 -500ml	줄기세포 기술
N2 보충제	17502048	써모피셔
뉴로기저	12348017	써모피셔
파라포름알데히드	158127	시그마
PBS-0.1 일회용 용기	상품코드 : IA-0.1-D-001	PBS 생명공학
PBS-MINI MagDrive 베이스 유닛	참조 : IA-UNI-B-501	PBS 생명공학
재조합 인간 BDNF	450-02	페프로텍
재조합 인간 bFGF/FGF2	100-18B	페프로텍
재조합 인간 FGF19	100-32	페프로텍
재조합 인간 GDNF	450-10	페프로텍
재조합 인간 SDF1	300-28ᅡ	페프로텍
ROCK 억제제	Y-27632 72302	줄기세포 기술
SB431542	S4317	시그마
자당	S7903	시그마
Tissue-Tek O.C.T. 컴파운드	제25608-930	폭스바겐

의 호 호 ) 호 년 년 년 (영어) 호