쥐의 뇌에서 종양 침투 면역 세포 분리

초록

출처: Baker, G. J., et al., Lowenstein, P. R. 신경교종 침투 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 유세포 분석. J. Vis. 특급. (2015년)

이 비디오는 기계적 해리와 효소 분해를 사용하여 쥐의 뇌에서 종양에 침투하는 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 다음에는 추가 분석을 위해 면역 세포를 수집하기 위해 밀도 구배 원심분리가 수행됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

멸균 플라스틱 용기에 담긴 264ml의 초순수 탈이온수(3.93x)에 90ml의 10x PBS를 넣어 밀도 원심분리 매체 혼합 용액을 준비합니다. HCl을 사용하여 pH 7.0-7.2로 적정하고 필터는 0.22μm 필터를 통해 멸균합니다. 4 °C에서 보관하십시오.

50ml 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 18ml의 밀도 원심분리 매체 혼합 용액과 30ml의 밀도 원심분리 매체(자세한 내용은 재료 목록 참조)를 결합하여 70% 밀도 원심분리 매체를 준비합니다. 4 °C에서 보관하되 사용하기 전에 RT로 가져 오십시오.

50ml 원심분리 튜브에 9.6ml의 DPBS와 10.4ml 70% 밀도 원심분리 매체를 결합하여 37% 밀도 원심분리 매체를 준비합니다. 4 °C에서 보관하되 사용하기 전에 RT로 가져 오십시오.

1. 신경교종 침투 PBMC의 분리

1. 깨끗하고 외날의 면도날을 사용하여 뇌의 중심을 시상으로 잘라 두 반구를 이등분하여 종양이 있는 뇌 영역을 분리합니다. 동측 반구 내측을 아래로 돌리고 소뇌와 후각구 수준에서 두 개의 관상 절개를 만들어 종양 임플란트를 포함하는 표적 조직을 분리합니다(그림 1A). 반대쪽 반구의 동등한 부분도 분리되어 음성 대조군으로 사용될 수 있습니다.
2. DPBS 1ml가 들어 있는 각각 라벨이 붙은 유리 Dounce 티슈 그라인더에 대상 조직을 넣고 플런저를 끝까지 누른 다음 7회 비틀어 처음에 조직을 파괴합니다. 플런저를 들어 올려 액체가 티슈 그라인더의 바닥으로 다시 가라앉을 수 있도록 합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다. 그러나 조직이 과도하게 분쇄되지 않도록 다음 두 번 반복 동안 플런저를 4번, 마지막 반복 동안 3번만 비틀어야 합니다.
3. P-1000 마이크로피펫을 사용하여 플런저 측면을 따라 1ml 용량의 얼음처럼 차가운 DPBS를 3개 순차적으로 도포하여 티슈 그라인더로 헹굽니다.
4. 위아래로 피펫팅하여 얼음 위에 표시된 15ml 원심분리기 튜브에 넣어 삼각화된 뇌 물질을 재현탁합니다. Dounce 티슈 그라인더의 측면을 얼음처럼 차가운 DPBS 1ml로 추가로 헹구고 동일한 15ml 원심분리기 튜브에 추가합니다. 모든 샘플이 처리될 때까지 분쇄된 뇌 물질이 들어 있는 모든 튜브를 얼음 위에 두십시오.
5. 모든 샘플이 처리되면 15ml 원심분리기 튜브의 삼중화된 뇌 물질을 740 x g(최대 RCF)에서 4°C에서 20분 동안 스핀다운합니다.
6. 10ml 혈청학적 피펫과 피펫 건으로 상층액을 제거하고 P-1000을 사용하여 이전에 준비된 콜라겐분해효소/DNase-I 소화 효소 1ml에 펠릿화된 뇌 물질을 재현탁합니다. 15ml 원심분리기 튜브를 시험관 랙에 넣고 37°C 수조에 15분 동안 넣습니다.
7. 조직 분해를 용이하게 하기 위해 튜브를 튕겨 배양 기간 동안 샘플을 두 번 부드럽게 교반합니다.
8. 소화 효소를 희석하기 위해 각 튜브에 10ml 혈청학적 피펫을 사용하여 6ml의 얼음처럼 차가운 DPBS를 추가합니다. 피펫을 위아래로 움직여 재현탁하고 멸균 70μm 나일론 메쉬 필터를 통해 총 부피를 얼음 위의 새로운 15ml 원심분리 튜브로 필터링합니다.
9. 뇌세포 현탁액을 740 x g(최대 RCF)에서 4°C에서 20분 동안 스핀다운하여 단일 세포 펠릿을 얻습니다(그림 1B). 원심분리기에서 15ml 튜브를 제거한 후 얼음 위에 놓고 원심분리기의 온도 설정을 약 21°C로 높여 다음 단계를 준비합니다.
10. 뇌 세포가 들어 있는 각 튜브에서 상층액을 완전히 제거하고 P-1000 마이크로피펫을 사용하여 1ml의 70% 밀도 원심분리 배지에 펠릿을 먼저 재현탁합니다. 그런 다음 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 각 튜브에 70% 밀도 원심분리 매체 4ml를 추가합니다. 캡을 단단히 조이고 튜브로 여러 번 부드럽게 반전시켜 세포 현탁액을 균질화합니다.
11. 70% 밀도 원심분리 매체에 재현탁된 뇌세포가 들어 있는 15ml 원심분리 튜브를 얼음에서 제거하고 RT의 시험관 랙에 놓습니다. 한 번에 하나씩 2ml의 37% 밀도 원심분리 배지 용액을 P-1000 마이크로피펫을 사용하여 5ml의 70% 밀도 원심분리 배지에 조심스럽게 오버레이하여 두 밀도 원심분리 배지 레이어 사이에 깨끗한 계면을 형성합니다(그림 1C).
    1. 끝이 세밀한 마커를 사용하여 인터페이스의 위치를 표시하면 원심분리 후 구분이 명확하지 않을 때 쉽게 식별할 수 있습니다.
12. 15ml 원심분리 튜브를 740 x g(최대 RCF)에서 20분 동안 중단 없이 RT에서 20분 동안 회전시켜 계면 중단이 발생하지 않도록 합니다.
13. 원심분리 후, 지질층을 조심스럽게 우회하여 P-200 마이크로피펫을 튜브의 측면을 따라 튜브에 삽입하여 두 밀도 원심분리 매체 층(그림 1D) 사이의 계면에 축적된 PBMC를 수집합니다.
    1. PBMC 밴드 수준에 도달하면 70% 밀도 원심분리 매체 층의 표면에서 200μl를 천천히 추출하고 얼음 위의 각각 레이블이 지정된 폴리프로필렌 FACS 튜브에 넣습니다. 샘플당 총 400μl의 부피에 대해 한 번 반복합니다.
14. 400μl의 PBMC가 들어 있는 각 FACS 튜브에 3ml의 플로우 버퍼를 추가하여 밀도 원심분리 매체를 충분히 희석한 다음 4°C에서 20분 동안 660 x g(최대 RCF)에서 셀을 스핀다운합니다.

결과

그림 1: 신경교종 침투 PBMC의 분리. (A) 초기 단계의 정소성 신경교종 임플란트를 포함하는 마우스 뇌 조직의 해부를 위한 전략. 상단 패널은 반대쪽 반구에서 멀리 떨어진 동측 반구의 시상 이등분을 보여줍니다. 하단 패널은 종양 임플란트를 포함하는 표적 조직을 분리하는 데 필요한 두 개의 추가 관상 절개를 보여줍니다(보라색으로 강조 표시됨). (B) 효소 분해, 70μm 나일론 메쉬를 통한 여과 및 원심분리 후 단세포 뇌 조직 펠릿(흰색 화살표). (C) 원심분리 전에 밀도 원심분리 매체 구배를 적절하게 주입했습니다. 흰색 화살표는 두 밀도 원심분리 매체 층 사이에 형성된 깨끗한 계면을 나타냅니다. (D)

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 독수리 매체 수정	지브코	제12430-054	4.5g/L D-글루코스, L-글루타민, 25mM HEPES 및 페놀 레드
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	지브코	14190-144	염화칼슘 또는 염화마그네슘이 없는 경우
소 태아 세럼	오메가 사이언티픽 Inc.	FB-11
페니실린 스트렙토마이신	지브코	15140-122	10,000U/ml 페니실린; 10,000μg/ml 스트렙토마이신
0.6ml 원추형 폴리프로필렌mi 마이크로튜브	제네시 사이언티픽	22-272
폴리우레탄 얼음 양동이	피셔브랜드	02-591-45	용량 : 0.152 온스 (4.5L)
콜라겐 분해 효소 (I-S형)	시그마 알드리치	C1639	Clostridium histolyticum 부터
데옥시리보뉴클레아제 I	워딩턴 생화학 공사	LS002007	> 건조 중량 당 2,000 Kunitz 단위
대형 해부 가위	테드 펠라 Inc.	1316
작은 해부 가위	증권 시세	14094-11
무딘 끝 집게	테드 펠라 Inc.	13250
7ml 유리 Dounce 티슈 그라인더	콘테스	KT885300-0007
Percoll 밀도 원심분리 매체	GE 헬스케어	GE17-0891-01
10 mL 혈청학적 피펫	제네시 사이언티픽	12-104	일회용; 멸균
70μm 멸균 나일론 메쉬 셀 스트레이너	피셔브랜드	22363548
15ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	제네시 사이언티픽	21-103	원뿔형 바닥
50ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	제네시 사이언티픽	21-108	원뿔형 바닥
12x75mm 둥근 바닥 폴리프로필렌 FACS 튜브	피셔브랜드	14-956-1B

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