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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 악기, 배양 배지 및 요리 준비
- 두 개의 스테인레스 스틸 실험실 해부 가위와 두 개의 스테인레스 스틸 실험실 집게를 준비하십시오. 모든 기구를 오토클레이브하고 살균을 위해 자외선(UV) 아래에서 배양 후드 O/N에 놓습니다.
- 500ml의 최소 필수 매체(MEM) 배양 배지(10% 소 태아 혈청[FBS], 20mM KCl, 25mM NaHCO3, 30mM D-글루코스, 2mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신 및 6μg/ml 암피실린)를 만들고 여과 살균합니다. 4 °C에서 몇 달 동안 보관하십시오.
- 14mm, 번호 1 두께의 커버 슬립을 포함하는 24 개의 우물 배양 플레이트를 준비합니다. 커버슬립을 오토클레이브하고 100mg/L 폴리-디-라이신(PDL)으로 코팅합니다. 자외선 살균 O/N.
2. 소뇌 과립 세포(CGC) 배양 용액의 준비
- 포도당 250mg, 소 혈청 알부민[BSA] 300mg, 인산염 완충 식염수[PBS] 955mg(Ca2+ 및 Mg+ 무함유) 및 3.8% MgSO4·7H2O1ml를 포함하는 고압 멸균, UV 광 처리, 멸균 dH2O에 '용액 A'(100ml)를 준비합니다.
- 용액 A 9ml에 희석된 5mg/ml 트립신 1ml를 포함하는 '용액 B'(10ml)를 준비합니다.
- 1,000 units DNase, 0.5 mg의 대두 트립신 억제제, 100 μl의 3.8% MgSO4·7H2O를 용액 A로 10 ml로 희석하여 함유한 '용액 C'(10 ml)를 준비합니다.
- 용액 C가 3.2ml인 '용액 D'(20ml)를 용액 A로 20ml로 희석하여 준비합니다.
- EBSS, 25mM NaHCO3, 3mM MgSO4·7H2O및 4% BSA, pH 7.4를 포함하는 BSA/Earle's Balanced Salt Solution(EBSS) 용액을 준비합니다.
- 5ml의 MEM 배양 배지에 순수 LME를 첨가하여 L-류신 메틸 에스테르(LME)를 준비하여 최종 농도를 150mM LME로 낮추고, 탁상용 pH 측정기를 사용하여 용액을 pH 7.4로 되돌리고, 28mm 폴리에테르 설폰(PES) 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 필터 멸균합니다.
3. CGC 배양
- 4-7일 된 새끼 쥐에서 소뇌를 수집합니다. 얼음 위에 5ml 용액 A가 들어있는 페트리 접시에 즉시 놓습니다.
- 소뇌에서 여분의 용액을 붓고 조직을 페트리 접시 뚜껑에 넣습니다.
- 불꽃이 잘 나는 면도날로 조직을 최소 세 방향으로 잘게 자릅니다.
- 다진 조직을 용액 B에 추가하고(제한된 조직이 손실되도록 용액으로 페트리 접시를 헹굽니다) 37°C의 수조에 5분 동안 넣습니다. 2분마다 부드럽게 흔듭니다.
- 용액 D(20ml)를 튜브에 넣어 트립신을 중화시키고 흔들어 65 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상등액을 붓습니다.
- 현탁액이 가능한 한 균질해질 때까지 직경 감소의 화염 유리 피펫 3개로 C. Triturate 웰 4ml(각각 약 10회)에 재현탁합니다.
- 이 균질산염을 BSA/EBSS 위에 천천히 부드럽게 몇 방울 떨어뜨립니다. BSA/EBSS를 통해 가라앉기 시작하면 더 분쇄하거나 용액 C를 조금 더 추가하십시오. 균질액은 BSA/EBSS 상단의 층에 위치해야 합니다. 흔들지 마십시오. 100 x g에서 5분 동안 회전합니다.
- 상층액을 제거하고 펠릿(부드러운)을 MEM 배지 1ml에 재현탁합니다.
- 혈구계를 사용하여 500μl의 MEM 배지에서 800,000 cells/coverslip에서 플레이트를 사용하여 세포를 계수합니다. 37 ° C의 인큐베이터에 6 % CO2로 놓습니다.
- 다음 날(준비 후 24-36시간)에 매체를 변경합니다. 10μM의 세포주기 억제제인 아라비노푸라노실시티딘(AraC)을 함유하는 MEM 배지 용액을 만듭니다.
- 각 커버슬립에 대해 250μl의 기존 배지를 새로운 24웰 플레이트에 유지하고, 나머지는 흡입하고, 250μl의 일반 MEM 배지를 추가하고, 이를 흡인하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 250μl의 기존 배지를 세포에 다시 추가하고 250μl의 AraC 함유 배지를 채웁니다.
메모: 세포는 in vitro(DIV) 6일부터 사용할 수 있습니다.
4. 미세아교세포를 선택적으로 고갈시키기(6 DIV에서 수행)
- MEM 배지의 별도 분취액 5ml에 순수 LME를 첨가하여 150mM LME의 최종 농도를 얻습니다.
- 용액을 pH 7.4로 되돌리고 28mm 폴리에테르 설폰(PES) 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 필터 멸균합니다.
- MEM 배지에서 용액을 50mM(2 x LME) 농도로 희석하고 대조군 배양을 위해 일반 MEM 배지와 함께 37oC의 수조에 10분 동안 놓습니다.
- CGC 배양에서 MEM 배지의 절반(250μl)을 제거하고 37°C에서 유지합니다.
- 2 x LME(250 μl)를 포함하는 MEM 배지, 즉 1:1로 희석되어 25mM의 웰 농도를 제공하는 MEM 배지로 세포를 처리하거나 대조군 배양을 위해 LME(250 μl)가 없는 예열된 MEM 배지로 세포를 처리합니다.
- 37°C의 가습 분위기에서 6% CO2로 1시간 동안 세포를 배양합니다.
- 사전 예열된 MEM 배지에서 세포를 두 번 세척하여 LME 함유 배지를 제거한 다음 잔류 배양 배지와 동일한 부피의 신선한 예열 MEM 배지를 해당 웰로 교체합니다.
- 배양액을 인큐베이터(37°C에서 6%CO2로 가습)에 다시 넣고 추가 처리 전에 24시간 동안 그대로 둡니다.