쥐의 뇌 유래 신경교세포(Rat Brain-derived glial cell)의 3차원 배양 확립

초록

출처: Koss, K. M, et al. 신경염증의 체외 모델링을 위한 1차 신경교세포의 개선된 3D 하이드로겔 배양. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 신경교세포의 3차원 배양을 확립하는 기술을 보여줍니다. 쥐 뇌 유래 신경교세포는 세포외 기질 성분을 포함하는 광가교결합 가능한 고분자 기질 내에 캡슐화되어 있습니다. 성장 배지에서 배양하면 신경교세포가 지지 매트릭스 내에서 증식하여 3차원 배양을 생성합니다.

프로토콜

참수로 안락사된 1일차 Sprague Dawley 새끼 쥐의 뇌 조직을 추출하기 위한 프로토콜이 앨버타 대학의 동물 보호 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 미세아교세포와 성상교세포 분리

참고: 분리 및 세포 배양을 위한 모든 배지는 수조에서 37°C로 예열됩니다. 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)에는 1%의 페니실린-스트렙토마이신(PS)이 함유되어 있습니다. Ham의 F12 영양 혼합물(DMEM/F12)이 함유된 모든 Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지에는 10%의 소 태아 혈청(FBS)과 1%의 페니실린-스트렙토마이신(PS)이 보충됩니다. 트립신과 혼합된 혼합물에만 FBS가 없습니다. 이 프로토콜의 모든 물질은 멸균(필터, 알코올, 구매 및 오토클레이브)이며 1.8단계 이후의 모든 단계는 무균 기술을 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.

1. 뇌당 50mL 코니컬 원심분리 튜브에서 15mL의 HBSS 및 12.5mL DMEM/F12를 37°C로 예열하고, 15mL 코니컬 원심분리 튜브에서 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 함유된 0.25% 트립신 약 2mL를 예열합니다. DMEM/F12 25mL를 추가로 가열합니다. 효소 활성의 손실을 방지하기 위해 사용 약 10분 전에 트립신을 따뜻하게 하십시오.
2. 따뜻한 HBSS를 6cm 및 10cm의 멸균 배양 접시에 충분히 부어 표면을 덮습니다. 두 개의 뇌마다 10cm 접시 1개와 추가로 6cm 접시를 준비합니다.
3. 각 2cm 10 접시에 최대 2개의 뇌를 놓습니다(그림 1A).
4. 해부 현미경으로 구부러진 집게와 곧은 집게를 사용하여 정중선을 따라 피질을 분리하고 뇌간과 소뇌를 분리합니다. 이를 통해 뇌당 3개의 조직 섹션이 생성됩니다(그림 1B).
5. 조직의 각 섹션에서 혈관을 포함하는 얇고 반투명한 조직 층(수막)을 벗겨내고 버리고 남은 조직을 별도의 배양 접시에 옮깁니다. 조직 절단면에 의해 노출된 얇은 층을 겸자로 잡고 주요 부분이 뇌 조직에 '매달려 있을' 때까지 조심스럽게 잡아당깁니다. 마지막으로 부드럽게 잡아당겨 이 부분을 제거합니다. 이 단계 전, 도중 및 이후의 대표 이미지는 그림 1C-1E를 참조하십시오.
6. 생물 안전 캐비닛에서 조직을 조심스럽게 유지하면서 배양 접시에서 남은 HBSS를 제거합니다. 메스로 조직을 침식하고 트립신으로 예열된 15mL 튜브에 조직을 옮깁니다.
7. 이 튜브를 37°C 수조에서 25분 동안 배양하여 조직을 효소로 소화시킵니다.
8. 튜브를 실온에서 500 x g으로 2분 동안 원심분리하고 상층액을 붓습니다.
9. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 10mL의 따뜻한 DMEM/F12를 첨가하여 트립신을 비활성화하고 용액을 5회 분쇄하여 조직을 분해합니다.
10. 튜브를 실온에서 500 x g으로 2분 동안 원심분리하고 상층액을 붓습니다.
11. 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 펠릿을 10mL의 따뜻한 DMEM/F12에 다시 현탁시키고 용액을 50mL 코니컬 원심분리 튜브로 옮깁니다.
12. 18게이지 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 용액을 3회 분쇄합니다.
13. 이 용액을 뇌당 12.5mL의 따뜻한 DMEM/F12 단위로 분배합니다.
14. 분쇄된 용액을 1mL 단위로 12웰 플레이트에 피펫팅합니다(뇌당 1개).
15. 37 °C 및 5% CO₂ 에서 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 배양합니다. 3일 후에 미디어를 교체하고 이후 3일마다 미디어를 새로 고칩니다. 2주 후에는 실험을 위해 세포를 수집할 수 있습니다.

2. 매크로머 합성

1. 50mL 원뿔형 원심분리 튜브에 히알루론산(HA) 염 375mg의 무게를 달고 증류수 37.5mL를 추가합니다.
2. 용액을 와류로 1 분 동안 세척하고 혼합물이 균질하게 나타나고 젤과 같은 점도를 잃을 때까지 혼합물을 초음파 처리합니다. 이 프로세스는 6시간이 걸릴 수 있습니다.
3. 마그네틱 교반 막대(38mm)가 있는 100mL 비커에 용액을 옮기고 실온에서 격렬하게 저어줍니다.
4. 5.0M NaOH를 혼합 HA에 조심스럽게 적정하고 pH가 8에서 12 사이에서 안정화될 때까지 pH 종이로 측정합니다.
5. 보관 중에 질소로 덮인 신선한 메타크릴 무수물(MA, 94%) 3mL를 수집합니다.
   메모: MA는 장시간(일) 동안 대기에 노출되면 반응성을 잃게 됩니다.
   주의: MA의 모든 사용은 흄 후드에서 이루어져야 합니다.
6. 200μL의 MA를 mixing HA 용액에 추가합니다. 반응은 용액의 pH를 8 이하로 낮춥니다.
7. 3mL의 MA가 용액에 추가될 때까지 2.4-2.6단계를 반복합니다. 이 프로세스는 최대 1-2시간이 소요될 수 있습니다.
8. 혼합하지 않고 4°C에서 밤새 반응을 계속하십시오.
9. 용액을 500mL 비커에 400mL의 차가운 에탄올(EtOH)로 옮기고 4°C에서 24 - 72시간 동안 침전시킵니다.
10. 용액의 주요 부분을 폐기를 위해 별도의 비커에 조심스럽게 기울인 다음 침전물을 50mL 원추형 원심분리기 튜브에 수집합니다. 필요한 경우 2-4 개의 튜브로 분배 할 수 있습니다.
11. 실온에서 200분 동안 원심분리기에서 2 x g의 튜브를 원심분리하고 상층액을 폐기합니다.
12. 튜브에 차가운 EtOH를 채우고 용액을 볼텍서와 1분 동안 혼합한 다음 2.10-2.11단계를 반복합니다.
13. 멸균 탈이온수 25mL를 넣고 용액을 와류와 1분 동안 혼합한 다음 초음파 처리(>20kHz)하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
14. 용액을 -80°C 냉동고에 15분 동안 또는 액체 질소에서 얼거나 급속 동결될 때까지 두십시오.
    주의: 액체 질소를 사용할 때는 보호 장갑, 안면 보호대, 앞치마를 사용하십시오.
15. 눈 같은 분말이 생성될 때까지 튜브(0.1mBar 및 -30°C 미만)를 24 - 48시간 동안 동결 건조합니다.
16. 이 시점에서 HA 백본에서 메틸 양성자(1.9ppm)에 비해 메타크릴레이트 양성자(6.1 및 5.6ppm에서 최고점)의 양을 확인할 수 있는 ^1H핵 자기 공명을 통해 샘플의 순도를 테스트합니다. 메틸 양성자에 대한 95% 메타크릴레이트의 최소 비율이 허용됩니다.

3. 겔 형성 및 3D 캡슐화

1. 커버슬립 및 금형 준비
   1. 50mL 원추형 원심분리 튜브에 2% 3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트의 50mL 증류수 용액을 만듭니다.
   2. 18mm 유리 커버슬립을 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 흔듭니다. 한 번에 최대 50개의 커버슬립을 추가할 수 있습니다.
   3. 커버슬립을 3개의 비커에 100mL 탈이온수에 각각 연속적으로 담궈 커버슬립을 헹굽니다.
   4. 커버슬립을 40°C의 진공 상태에서 건조기와 오븐으로 밤새 건조시킵니다.
   5. 집게로 개별 커버슬립을 70% EtOH에 빠르게 담그십시오.
   6. 건조하지 않고 각 커버슬립을 12웰 플레이트의 웰에 떨어뜨립니다.
   7. 멸균 탈이온수(웰당 1mL)로 각 웰을 세척하고 흡입합니다.
   8. 각 웰에 멸균 2μg/mL 폴리-L-라이신(PLL) 1mL를 추가하고 >2시간 동안 배양합니다.
   9. PLL 용액을 흡입하고 커버슬립이 자연 건조되도록 합니다.
   10. 폴리디메틸 실록산(PDMS) 몰드(그림 2 참조)를 70% EtOH에 담그고 각 커버슬립의 중앙에 하나씩 놓고 자연 건조하고 몰드와 유리 사이에 밀봉을 만듭니다.
       1. 바닥이 평평한 폴리스티렌 접시에 PDMS 프리믹스 시약을 10:1 비율로 주조하여 PDMS 주형을 준비합니다. 약 1mm 두께의 시트를 생성하기 위해 준비된 PDMS의 양을 선택합니다. PDMS에서 웰을 형성하려면 내경이 10인 서클 펀치로 시트를 자릅니다.
2. 세포 준비
   참고: 프로토콜의 모든 단계는 생물 안전 작업대에서 멸균 기술로 수행됩니다. 인산염 완충 식염수(PBS) 용액은 모든 단계에서 pH 7.4로 조정됩니다.
   1. 메타크릴화 히알루론산(HAMA)에서 세포 캡슐화 24시간 전에 12개의 웰 플레이트에서 2주간의 1차 배양(단계 1.15부터)을 위해 배지를 새로 고칩니다. 웰당 1mL의 DMEM/F12(10% FBS 및 1% PS) 배지를 추가합니다.
   2. 각 12-well plate 세포에 대해 12.5mL의 희석된 트립신(DMEM/F12 배지로 30% 희석된 0.25% 트립신-EDTA)과 25mL DMEM/F12(10% FBS 및 1% PS)를 준비하고 수조에서 37°C로 예열합니다.
   3. 10mL 혈청학적 피펫(웰당 0.5mL >)을 사용하여 플레이트에서 컨디셔닝된 배지를 수집하고, 남은 액체를 철저히 흡인하고, 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에서 20-30분 동안 농축 세포층이 플레이트에서 분리될 때까지 묽은 트립신(0.075% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA]) 당 1mL로 교체합니다.
   4. 1mL 피펫(단일 플로팅 조각으로 나타남)으로 부유 세포 물질을 회수하고 15mL 코니컬 원심분리 튜브에 수집합니다. 등가량의 DMEM/F12(10% FBS 및 1% PS)로 희석하고 실온에서 2분 동안 200 x g으로 원심분리하여 상층액을 버립니다.
   5. 세포 펠릿을 10mL 따뜻한 DMEM/F12(10% FBS 및 1% PS)에 재현탁하고, 10mL 피펫으로 세포를 5회 분쇄한 다음 200 x g에서 2분 동안 원심분리합니다.
   6. 상등액을 디캔팅하고 5mL 따뜻한 DMEM/F12에 세포를 다시 현탁시킨 다음 세포를 50mL 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   7. 18 게이지 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 세포 용액을 3회 분쇄하고 40μm 세포 체를 통해 현탁액을 새 원뿔형 원심분리 튜브로 여과합니다.
   8. 10μL의 세포 현탁액을 수집하고, 따뜻한 DMEM/F12에서 1:100으로 희석하고, 자동화된 세포 계수기로 세포를 계수합니다.
   9. 캡슐화 단계까지 37°C 수조에서 배양합니다.
3. 세포 캡슐화
   참고: 프로토콜의 모든 단계는 생물 안전 작업대에서 멸균 기술로 수행됩니다.
   1. 3D 하이드로겔의 각 12웰 플레이트에 대해 세포 전처리 중에 수집된 12.5mL의 DMEM/F12 및 12.5mL의 컨디셔닝된 DMEM/F12 배지를 가열합니다.
   2. 0.5% wt/vol의 최종 농도에 필요한 HAMA의 양을 계량합니다. 이 HAMA를 (2% wt/vol)의 농도로 멸균 여과된 PBS에 용해시킵니다. 세포 및 기타 시약의 첨가를 수용하기 위해 최종 농도보다 4배 높은 농도가 사용됩니다. 12웰 하이드로겔 플레이트 1개에는 7mg HAMA가 함유된 ~350μL PBS가 필요합니다.
   3. HAMA가 60분 동안 완전히 용해될 때까지 초음파 처리(>20kHz) 용액.
   4. 트리에탄올아민(TEA) 및 1-비닐-2-피롤리디논(NVP)의 개별 10% 용액과 멸균 PBS pH 7.4의 1mL 분취액에 1mM Eosin Y(EY) 용액을 준비합니다.
   5. 1개의 12웰 플레이트에 대해 1 x 10⁷ 셀, 0.5% wt/vol HAMA(2% wt/vol 350μL), 0.1% TEA(14μL of 10%), 0.1% NVP(14μL of 10%) 및 0.01mM EY(14μL of 1mM) 및 20% 기저 층류 혼합물(280μL 스톡)의 최종 1.4mL 혼합물을 만듭니다. 나머지 볼륨은 PBS입니다.
   6. 1mL 팁을 사용하여 용액과 피펫 100μL를 각 PDMS 금형에 부드럽게 혼합합니다.
   7. 샘플을 실온에서 5분 동안 고강도 녹색 LED 조명(~520nm, 60mW, 밀폐된 20cm x 20cm x 20cm 상자 내)에 노출시킵니다.
   8. 12웰 플레이트에 온열 컨디셔닝된 DMEM/F12 웰당 1mL를 추가합니다.
   9. 엄지와 검지 사이의 각 커버슬립을 잡고 구부러진 핀셋으로 PDMS 몰드를 천천히 벗겨내고 젤이 변위되지 않도록 주의하고 컨디셔닝 배지가 있는 웰에 넣습니다.
   10. 각 웰에 1mL의 따뜻한 DMEM/F12를 추가로 추가합니다.
   11. 37°C에서 5% CO₂로 플레이트를 2주 동안 배양하고, 각 웰에서 1mL의 배지를 피펫팅하고 1mL DMEM/F12로 교체하여 매주 세포 배지를 새로 고칩니다.

결과

그림 1: 1일차 Sprague Dawley 쥐 새끼 뇌 해부.전뇌(A), 피질과 소뇌 해부(B), 수막이 있는 단일 피질(C), 겸자로 수막을 벗겨낸 이미지(D), 수막이 없는 피질(E)의 이미지.

그림 2: 메타크릴화 히알루론산(HAMA) 기반 3D 세포 배양 및 광중합 프로토콜의 개략도.신경교세포(2주 1차...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1. HAMA 종합 및 광중합을 위한 재료
히알루론산(HA)	시그마-알드리치	53747-10지	연쇄상 구균, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6
메타크릴 무수물(MA)	시그마-알드리치	275585-100ML
수산화나트륨(NaOH)	시그마-알드리치	221465-25지
에탄올(EtOH)	상업 알코올 Inc.		무수
인산염 완충 식염수(pH 7.4) 정제	피셔 사이언티픽	18912014
트리에탄올아민(TEA)	시그마-알드리치	90279-100ML
1- 비닐 -2pyrrolidinone (NVP)	시그마-알드리치	V3409-5G
에오신 Y (EY)	시그마-알드리치	E6003-25G
폴리디메틸실록산(PDMS) Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	다우코닝
3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트	시그마-알드리치	440159-100ML
비커(100mL)	코 닝	1000-100
비커(500mL)	코 닝	1000-600
pH 용지(Labstick)	시그마-알드리치	9580
2. 신경교세포 분리 및 세포 배양을 위한 재료
P1-2 Sprague Dawley 쥐 새끼	찰스 리버	CD Sprague Dawley 쥐 균주 코드 001
해부기 가위 - 슬림 블레이드(소형)	정밀 과학 도구	14081-09
수술용 가위 - Toughcut(대형)	정밀 과학 도구	14130-17
가는 집게(Dumont #5)	정밀 과학 도구	11521-10
곡선형 파인 펜셉스(Dumont #7)	정밀 과학 도구	11271-30
행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)	지브코	제14170-112
Dulbecco의 변형 독수리 배지와 Ham의 영양 혼합물 F-12 (DMEM/F12)	지브코	제11320-033
페니실린-스트렙토마이신(PS)	지브코	15140-122
소 태아 혈청(FBS)	지브코	제12483-020
0.25% 트립신 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	지브코	제25200-072
폴리-L-라이신(PLL)	시그마-알드리치	P-6282
50 mL 코니컬 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	05-539-13
15 mL 코니컬 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	05-539-5
12웰 조직배양처리플레이트(Cellstar)	Greiner 바이오 원	665 108
10 mL 혈청학적 피펫	피셔 사이언티픽	13-676-10층
25 mL 혈청학적 피펫	피셔 사이언티픽	12-676-10케이
페트리 접시 (60mm X 15mm)	피셔 사이언티픽	FB0875713A
페트리 접시 (100mm X 15mm)	피셔 사이언티픽	FB0875712
현미경 커버슬립(18mm)	피셔 사이언티픽	12-545-100 18CIR

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