인간 만능 줄기 세포를 이용한 천체권 생성 및 유지

Abstract

출처: Cvetkovic, C., et al. 인간 만능 줄기 세포의 성상세포 및 뉴런의 3D 공동 배양을 사용한 시냅스 미세 회로 모델링. J. Vis. 특급. (2018).

이 비디오는 인간 만능 줄기 세포의 전구 세포에서 천체권을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 성장 인자와 키나아제 억제제를 포함하는 영양 배지를 가진 줄기 세포의 성장과 증식을 포함합니다. 그런 다음 이 세포는 응집되어 성상세포로 분화하여 천체권을 형성합니다.

Protocol

1. 세포 배양 및 시약 준비

1. 세포 배양을 위해 코팅된 플레이트를 준비합니다.
   1. DMEM/F12 배지로 ECM(extracellular matrix) 코팅 용액을 희석하여 1mg/mL 원액을 준비합니다. 희석된 ECM 원액을 각각 3mL의 원뿔형 튜브 30개에 분취하고 즉시 -20°C에서 보관합니다. 작동하는 용액의 경우, 3mL의 ECM 스톡을 33mL의 사전 냉각된 DMEM/F12 매체에 재현탁시켜 총 부피를 36mL로 만들고 80μg/mL의 농도를 만듭니다.
   2. 6-well 세포 배양 플레이트의 웰당 1mL를 ECM 작업 용액으로 코팅합니다. 웰당 1mL DMEM/F12를 추가로 추가하여(필요한 경우) 웰 표면이 완전히 덮이도록 합니다. 코팅된 6-well 세포 배양 플레이트를 사용하기 전에 최소 1시간 동안 실온에 두십시오.
      참고: 코팅된 플레이트는 인큐베이터 또는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
2. 배지 제형, 성장 인자 및 소분자를 준비합니다.
   1. 500mL의 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 배지를 준비하려면 제조업체의 지침에 따라 20x 및 500x 보충제를 추가합니다.
   2. 500mL의 신경 배지(NM)를 준비하려면 앞서 설명한 대로 L-글루타민 보충제가 포함된 DMEM/F12 500mL 병에 최종 농도 2mg/mL, 항생제/항진균 용액 1배, B27 보충제 1개 또는 N2 보충제 1개에 헤파린을 첨가합니다.
   3. Rho-kinase 억제제 Y27632(Y)의 10mM(1,000x) 원액을 준비하려면 3mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 분말 10mg을 추가합니다. 여과, 멸균, 분취 및 -20 °C에서 보관하십시오. 매체에서 10 μM 작업 농도로 사용하십시오.
   4. 20mM(10,000x)의 SB431542 원액을 준비하려면 1.3mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 10mg의 분말을 첨가합니다. DMH1의 2mM(1,000x) 원액을 준비하려면 13.1mL의 DMSO에 10mg의 분말을 첨가합니다. 각 용액을 여과, 멸균, 분취 및 -20°C에서 보관합니다. 각 용액을 매체(NM + SB431542 + DMH1)에서 2μM 작업 농도로 사용합니다.
      메모: 이 프로토콜은 우리의 관찰 및 다른 사람들의 보고를 기반으로 SB431542과 DMH1 모두의 2μM 작업 농도를 권장하며, 이 농도가 hPSC의 신경 유도를 효과적으로 촉진한다는 내용입니다. 더 높은 농도도 보고되었습니다30. 또한, 대체 배지를 사용하면 높은 신경 전환에 작은 분자가 필요하지 않다는 사실도 밝혀졌습니다. 따라서 작업 농도는 대체 세포 배양 환경에 따라 달라지며 최적의 농도는 개별 연구자가 테스트해야 합니다.
   5. 표피 성장 인자(EGF) 및 섬유아세포 성장 인자-2(FGF2)의 개별 100μg/mL(10,000x) 원액을 준비하려면 PBS + 0.1% BSA 10mL에 각각 1mg을 첨가합니다. EGF 및 FGF2 원액을 50μL 분취액에 넣고 -80°C에서 보관합니다. 각각 10ng/mL의 작업 농도로 배지에서 사용합니다. 예를 들어, 5μL EGF 및 5μL FGF2를 50mL의 NM(NM + EGF + FGF2)에 추가합니다.
   6. 독시사이클린 하이드로클로라이드(Dox)의 원액을 제조하려면 먼저 DMSO에 분말을 100mg/mL로 용해하고 -20°C에서 보관하십시오. 또한, PBS에서 2 mg/mL (1,000x) 원액을 만들기 위해 희석하고 -20 °C에서 보관합니다. 매체에서 2 μg/mL 작업 농도로 사용하십시오. 예를 들어, 50mL의 NM(NM + Dox)에 50μL Dox를 추가합니다.
      메모: 해동 후 용액을 다시 얼리지 마십시오.

2. 인간 유도 만능 세포(hPSC)에서 신경 아형 생성

참고: 모든 세포 배양은 37°C에서 5% CO2의 인큐베이터에서 유지되어야 합니다. 이러한 배양물은 실내 산소 수준으로 유지되지만 더 낮은 수준이 사용될 수 있습니다.

1. hPSCs.
   에서 성상세포 전구세포(hAstros) 생성 및 유지 관리 메모: 이 섹션에서는 간략하고 간소화된 차별화 프로토콜을 제공합니다. 자세한 설명(배아체 형성, 로제트 선택 및 지역 패터닝 단계 포함)은 앞서 설명한 프로토콜(그림 1A, 녹색 점선 상자)을 참조하십시오.
   1. 웰당 2mL의 hPSC 배지 + Y를 사용하여 ECM으로 코팅된 6웰 플레이트(단계 1.1 참조)에 hPSC의 클러스터를 시드합니다. 줄기세포가 약 50% 합류하고 필요에 따라 분열될 때까지 매일 줄기세포를 공급합니다.
      1. hPSC를 분리하려면 1mL의 패시징 시약을 well에 추가하고 1분 후에 흡인합니다. 실온에서 5분 동안 세포를 배양하고, 1mL의 hPSC 배지를 추가한 다음, 웰당 2mL의 hPSC 배지 + Y에서 새로운 ECM 코팅 웰에 응집체를 1:10으로 분할합니다.
   2. 줄기세포가 약 50% 융합될 때까지 유지한 다음 배지를 NM + SB431542 + DMH1로 변경하여 신경 분화를 유도합니다(0일차). 세포가 약 95% 융합되면 동일한 배지에서 새로운 ECM 코팅 웰로 1:6으로 분할합니다.
   3. 14일째에 분리 용액으로 세포를 해리하고 Y가 있는 코팅되지 않은 플라스크로 옮겨 응집체 형성을 촉진합니다.
      메모: Y의 첨가는 세포 생존 및 구 형성을 촉진하는 데 사용되지만 모든 공급 중에 포함되지는 않습니다.
   4. 뉴런 전구 세포와 뉴런(hNeuron)의 생성을 위해 아래 설명된 대로 이 14일차 세포를 사용하십시오. 또는 신경 세포 성숙이 일어나거나 신경교 형성이 시작되기 전에 단층 또는 구 배양의 나중 시점에서 이러한 세포를 활용하십시오.
      메모: 기본적으로 이 프로토콜은 배측-피질 성상세포를 생성합니다. 그러나 성상세포 아형은 원하는 경우 패터닝 모르포겐을 추가하여 지역적으로 지정할 수 있습니다. 레티노산(RA)을 첨가하여 세포를 척수 표현형으로 분류할 수 있으며, 음파 고슴도치(SHH), 평활 작용제(SAG) 또는 푸르모르파민은 복부 표현형을 생성합니다.
   5. 자발적으로 형성된 3D 응집체(hAstrospheres)에서 성상교세포 전구세포와 성상세포를 생성하려면 NM + EGF + FGF2로 전환하고 이전에 자세히 설명한 대로 매주(또는 안정적인 pH를 보장하기 위해 필요한 만큼) 공급합니다.
      1. 어두운 중심이 나타날 때 분리 용액으로 hAstro 응집체를 부드럽게 해리하고 자발적으로 부착되는 구체를 제거합니다. 일주일에 한 번 구체를 부드럽게 부수어 구체의 건강을 유지하고 괴사 코어를 피하십시오.
         메모: 박리 용액으로 5분을 초과하지 마십시오.
      2. 4-6개월의 팽창 후 세포 식별을 확인하고 동결 보존 배지(제조업체의 지침에 따름) 또는 액체 질소에 장기 보존을 위한 대체 보관 조건에서 동결하거나 실험에 즉시 사용합니다.

Results

그림 1 : hPSC에서 파생된 3D 신경 구체의 분화 및 형성에 대한 단계적 묘사. (A) 프로토콜의 주요 단계에 대한 타임라인. (B) 인간 유도 만능 줄기 세포(hPSC)에서 순수 신경 세포 집단을 생성할 수 있습니다. 성상교세포 전구세포(점선 녹색 상자)의 생성은 2.1단계를 참조하십시오. (C) neurogenin 2의 유도된 과발현을 통해 형질전환 hPSC에서 생성된 유도성 뉴런(iNeurons, 섹션 2.2 참조)은 2D ECM(7일차)에서 뉴런 형태학을 보여주고 MAP2(삽입 사진)에 대해 양성입니다. (D) 마이크로웰 플레이트에서 제거된 구체는 고처리량 스크리닝을 위해 일관된 크기를 보여줍니다. 구체는 핵융합을 방지하기 위해 원하는 경우 스피너 플라스크 생물 반응기에서 배양 할 수 있습니다. 스케일 바 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6웰 플레이트	피셔 사이언티픽	08-772-1B
15ml 원뿔형 튜브	Olympus 플라스틱	28-101
아카쿠타아제	시그마	A6964-100ML	분리 솔루션
AggreWell 플레이트	스템셀 기술	34850
Anti-Adherence 헹굼 솔루션	스템셀 기술	7010	마이크로웰 플레이트에 대한 세포 접착 방지
안티/안티	써모피셔	15240062
나27	써모피셔	17504044	미디어 보충 자료
BrainPhys 뉴런 배지	스템셀 기술	5790	신경생리학적 기초 매체 대안
크라이오스토어 CS10	스템셀 기술	7930	10% DMSO를 함유한 동결 보존 배지
DMEM/F12	써모피셔	제10565-042	GlutaMAX 보충제 함유
재질 보기 DMH-1	스템셀 기술	73634	위험: 삼키면 유독합니다. 작업 농도 : 2 uM
독시사이클린 염산염(Dox)	시그마	D3072-1ml	위험: 임산부에게 유독합니다. 작동 농도 : 2ug / mL
표피 성장 인자(EGF)	페프로텍	AF-100-15	작업 농도 : 10 ng / mL
섬유아세포 성장 인자-2 (FGF)	페프로텍	100-18B	작업 농도 : 10 ng / mL
혈구계 또는 자동 세포 계수기	생명 기술	AMQAX1000
Matrigel 멤브레인 매트릭스	코 닝	제354230	ECM 코팅 솔루션. 작업 농도 : 80 ug / ml. 얼음 위에서 준비하고 피펫, 튜브 및 미디어가 미리 냉각되었는지 확인하십시오.
마운팅 솔루션
엔2	써모피셔	17502048	미디어 보충 자료
인산염 완충 식염수(PBS)	스템셀 기술	CA008-300
ReLeSR	스템셀 기술	5872	분리 및 패시에이징 시약
로키나아제 억제제 Y27632- (Y)	토크리스	1254	작업 농도 : 10 uM
SB431542	스템셀 기술	72234	작업 농도 : 2 uM
T25 배양 플라스크	Olympus 플라스틱	25-207	벤티드 캡
T75 배양 플라스크	Olympus 플라스틱	25-209	벤티드 캡