인간 만능 줄기 세포를 이용한 천체권 생성 및 유지

초록

출처: Cvetkovic, C., et al. 인간 만능 줄기 세포의 성상세포 및 뉴런의 3D 공동 배양을 사용한 시냅스 미세 회로 모델링. J. Vis. 특급. (2018).

이 비디오는 인간 만능 줄기 세포의 전구 세포에서 천체권을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 성장 인자와 키나아제 억제제를 포함하는 영양 배지를 가진 줄기 세포의 성장과 증식을 포함합니다. 그런 다음 이 세포는 응집되어 성상세포로 분화하여 천체권을 형성합니다.

프로토콜

1. 세포 배양 및 시약 준비

1. 세포 배양을 위해 코팅된 플레이트를 준비합니다.
   1. DMEM/F12 배지로 ECM(extracellular matrix) 코팅 용액을 희석하여 1mg/mL 원액을 준비합니다. 희석된 ECM 원액을 각각 3mL의 원뿔형 튜브 30개에 분취하고 즉시 -20°C에서 보관합니다. 작동하는 용액의 경우, 3mL의 ECM 스톡을 33mL의 사전 냉각된 DMEM/F12 매체에 재현탁시켜 총 부피를 36mL로 만들고 80μg/mL의 농도를 만듭니다.
   2. 6-well 세포 배양 플레이트의 웰당 1mL를 ECM 작업 용액으로 코팅합니다. 웰당 1mL DMEM/F12를 추가로 추가하여(필요한 경우) 웰 표면이 완전히 덮이도록 합니다. 코팅된 6-well 세포 배양 플레이트를 사용하기 전에 최소 1시간 동안 실온에 두십시오.
      참고: 코팅된 플레이트는 인큐베이터 또는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
2. 배지 제형, 성장 인자 및 소분자를 준비합니다.
   1. 500mL의 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 배지를 준비하려면 제조업체의 지침에 따라 20x 및 500x 보충제를 추가합니다.

결과

그림 1 : hPSC에서 파생된 3D 신경 구체의 분화 및 형성에 대한 단계적 묘사. (A) 프로토콜의 주요 단계에 대한 타임라인. (B) 인간 유도 만능 줄기 세포(hPSC)에서 순수 신경 세포 집단을 생성할 수 있습니다. 성상교세포 전구세포(점선 녹색 상자)의 생성은 2.1단계를 참조하십시오. (C) neurogenin 2의 유도된 과발현을 통해 형질전환 hPSC에서 생성된 유도성 뉴런(iNeurons, 섹션 2.2 참조)은 2D ECM(7일차)에서 뉴런 형태학을 보여주고 MAP2(삽입 사진)에 대해 양성입니다. (D) 마이크로웰 플레이트에서 제거된 구체는 고처리량 스크리닝을 위해 일관된 크기를 보여줍니다. 구체는 핵융합을 방지하기 위해 원하는 경우 스피너 플라스크 생물 반응기에서 배양 할 수 있습니다. 스케일 바 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6웰 플레이트	피셔 사이언티픽	08-772-1B
15ml 원뿔형 튜브	Olympus 플라스틱	28-101
아카쿠타아제	시그마	A6964-100ML	분리 솔루션
AggreWell 플레이트	스템셀 기술	34850
Anti-Adherence 헹굼 솔루션	스템셀 기술	7010	마이크로웰 플레이트에 대한 세포 접착 방지
안티/안티	써모피셔	15240062
나27	써모피셔	17504044	미디어 보충 자료
BrainPhys 뉴런 배지	스템셀 기술	5790	신경생리학적 기초 매체 대안
크라이오스토어 CS10	스템셀 기술	7930	10% DMSO를 함유한 동결 보존 배지
DMEM/F12	써모피셔	제10565-042	GlutaMAX 보충제 함유
재질 보기 DMH-1	스템셀 기술	73634	위험: 삼키면 유독합니다. 작업 농도 : 2 uM
독시사이클린 염산염(Dox)	시그마	D3072-1ml	위험: 임산부에게 유독합니다. 작동 농도 : 2ug / mL
표피 성장 인자(EGF)	페프로텍	AF-100-15	작업 농도 : 10 ng / mL
섬유아세포 성장 인자-2 (FGF)	페프로텍	100-18B	작업 농도 : 10 ng / mL
혈구계 또는 자동 세포 계수기	생명 기술	AMQAX1000
Matrigel 멤브레인 매트릭스	코 닝	제354230	ECM 코팅 솔루션. 작업 농도 : 80 ug / ml. 얼음 위에서 준비하고 피펫, 튜브 및 미디어가 미리 냉각되었는지 확인하십시오.
마운팅 솔루션
엔2	써모피셔	17502048	미디어 보충 자료
인산염 완충 식염수(PBS)	스템셀 기술	CA008-300
ReLeSR	스템셀 기술	5872	분리 및 패시에이징 시약
로키나아제 억제제 Y27632- (Y)	토크리스	1254	작업 농도 : 10 uM
SB431542	스템셀 기술	72234	작업 농도 : 2 uM
T25 배양 플라스크	Olympus 플라스틱	25-207	벤티드 캡
T75 배양 플라스크	Olympus 플라스틱	25-209	벤티드 캡

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