시냅스 형성을 유도하기 위해 성상세포와 뉴런의 3D 공동 배양 구체 생성

초록

출처: Cvetkovic, C., et al. 인간 만능 줄기 세포의 성상 세포 및 뉴런의 3D 공동 배양을 사용한 시냅스 미세 회로 모델링. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 성상세포와 뉴런을 공동 배양하여 3D 구를 형성하는 절차를 보여줍니다. 이러한 3D 구체는 시냅스 형성 및 신경망 통합을 조사하기 위한 고유한 플랫폼을 제공하여 발달 신경 과학, 신경 퇴행성 질환 및 신경 약리학적 중재 연구를 위한 잠재적 모델 역할을 합니다.

프로토콜

1. 3D Sphere Cocultures의 준비 및 유지 관리

1. 현탁액에서 3D 응집체에서 hAstros를 분리합니다.​
   1. 어두운 중심이 나타나면 분리 용액으로 human astrocyte(hAstro) 응집체를 부드럽게 해리하고 자발적으로 부착되는 구체를 제거합니다. 일주일에 한 번 구체를 부드럽게 부수어 구체의 건강을 유지하고 괴사 코어를 피하십시오.
      알림: 박리 용액으로 5분을 초과하지 마십시오.
2. 2D 단층에서 hNeurons 또는 iNeurons를 해리합니다.
   1. 6-well 플레이트에서 배지를 제거하고 hNeuron(인간 뉴런) 또는 iNeuron(유도성 뉴런)의 웰이 포함된 각 단층 배양액에 500μL의 분리 용액을 추가합니다. 37 ° C에서 5 분 동안 배양하십시오. 2-3mL DMEM/F12 기저 배지를 부드럽게 첨가하여 부착된 세포를 제거합니다.
   2. 15mL 코니컬 튜브에 세포와 배지를 모으고 300 x g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 1mL의 새 배지를 추가한 다음 1,000μL 마이크로....

결과

그림 1: 생명공학적 3D 신경 구체의 체계적이고 재현 가능한 생성. (A) 마이크로웰(μ-well) 배양 플레이트는 원하는 밀도와 뉴런 대 성상세포 비율의 3D 신경 구체를 체계적이고 사용자 지정된 방식으로 형성하여 일관된 크기와 모양을 생성하는 데 사용됩니다. 이미지는 구 형성 1일 후에 표시됩니다. 스케일 바 = 200μm. (B) 시작 셀 밀도 범위(마이크로웰당 4 x 10³에서 2 x 10,⁴ 셀)는 다양한 크기의 구체를 생성합니다. 마이크로웰 플레이트가 없는 경우, hPSC는 결합되어 일주일 후에 직경이 확산 한계를 초과하는 훨씬 더 크고 불균일한 응집체를 형성합니다(n = 그룹 및 시점당 6-.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6웰 플레이트	피셔 사이언티픽	08-772-1B
15ml 원뿔형 튜브	Olympus 플라스틱	28-101
아카쿠타아제	시그마	A6964-100ML	분리 솔루션
AggreWell 플레이트	스템셀 기술	34850
Anti-Adherence 헹굼 솔루션	스템셀 기술	7010	마이크로웰 플레이트에 대한 세포 접착 방지
안티/안티	써모피셔	15240062
나27	써모피셔	17504044	미디어 보충 자료
BrainPhys 뉴런 배지	스템셀 기술	5790	신경생리학적 기초 매체 대안
DMEM/F12	써모피셔	제10565-042	GlutaMAX 보충제 함유
재질 보기 DMH-1	스템셀 기술	73634	위험: 삼키면 유독합니다. 작업 농도 : 2 uM
당나귀 세럼	Lampire 생물학 연구소	7332100	작동 농도: 1차 차단 버퍼에서 5%, 2차 차단 버퍼에서 1%
독시사이클린 염산염(Dox)	시그마	D3072-1ml	위험: 임산부에게 유독합니다. 작동 농도 : 2ug / mL
표피 성장 인자(EGF)	페프로텍	AF-100-15	작업 농도 : 10 ng / mL
섬유아세포 성장 인자-2 (FGF)	페프로텍	100-18B	작업 농도 : 10 ng / mL
혈구계 또는 자동 세포 계수기	생명 기술	AMQAX1000
Matrigel 멤브레인 매트릭스	코 닝	제354230	ECM 코팅 솔루션. 작업 농도 : 80 ug / ml. 얼음 위에서 준비하고 피펫, 튜브 및 미디어가 미리 냉각되었는지 확인하십시오.
MEA 2100 시스템	멀티채널 시스템	MEA2100
로키나아제 억제제 Y27632- (Y)	토크리스	1254	작업 농도 : 10 uM
SB431542	스템셀 기술	72234	작업 농도 : 2 uM
스피너 플라스크	피셔 사이언티픽	4500-125
T25 배양 플라스크	Olympus 플라스틱	25-207	벤티드 캡
트리판 블루	인비트로젠	T10282

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