시냅스 형성을 유도하기 위해 성상세포와 뉴런의 3D 공동 배양 구체 생성

초록

출처: Cvetkovic, C., et al. 인간 만능 줄기 세포의 성상 세포 및 뉴런의 3D 공동 배양을 사용한 시냅스 미세 회로 모델링. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 성상세포와 뉴런을 공동 배양하여 3D 구를 형성하는 절차를 보여줍니다. 이러한 3D 구체는 시냅스 형성 및 신경망 통합을 조사하기 위한 고유한 플랫폼을 제공하여 발달 신경 과학, 신경 퇴행성 질환 및 신경 약리학적 중재 연구를 위한 잠재적 모델 역할을 합니다.

프로토콜

1. 3D Sphere Cocultures의 준비 및 유지 관리

1. 현탁액에서 3D 응집체에서 hAstros를 분리합니다.​
   1. 어두운 중심이 나타나면 분리 용액으로 human astrocyte(hAstro) 응집체를 부드럽게 해리하고 자발적으로 부착되는 구체를 제거합니다. 일주일에 한 번 구체를 부드럽게 부수어 구체의 건강을 유지하고 괴사 코어를 피하십시오.
      알림: 박리 용액으로 5분을 초과하지 마십시오.
2. 2D 단층에서 hNeurons 또는 iNeurons를 해리합니다.
   1. 6-well 플레이트에서 배지를 제거하고 hNeuron(인간 뉴런) 또는 iNeuron(유도성 뉴런)의 웰이 포함된 각 단층 배양액에 500μL의 분리 용액을 추가합니다. 37 ° C에서 5 분 동안 배양하십시오. 2-3mL DMEM/F12 기저 배지를 부드럽게 첨가하여 부착된 세포를 제거합니다.
   2. 15mL 코니컬 튜브에 세포와 배지를 모으고 300 x g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 1mL의 새 배지를 추가한 다음 1,000μL 마이크로피펫으로 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다.
3. 마이크로웰 배양 플레이트를 사용하여 3D 구를 형성합니다.
   1. 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 0.5mL의 접착 방지 헹굼 용액을 추가하여 플레이트를 준비합니다. 2,000 x g에서 5분 동안 원심분리기 플레이트. 헹굼 용액을 흡입하고 각 웰에 DMEM/F12 기초 배지 1mL를 추가하여 세척한 다음 다시 흡입합니다.
      메모: 사용하는 동안 항상 원심분리기가 균형을 이루고 있는지 확인하십시오.
   2. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 각 세포 유형을 계수합니다. 총 2mL의 신경 매질(NM) + Y(iNeurons를 사용하는 경우 Dox 포함)의 부피에서 해리된 hAstros 및 hNeurons 또는 iNeurons의 원하는 비율을 각 웰에 추가합니다. 원심분리기 플레이트를 100 x g에서 3분 동안 가열한 후 인큐베이터로 다시 넣습니다.
      참고: 24웰 마이크로웰 플레이트(재료표 참조)에는 웰당 300개의 마이크로웰이 포함되어 있습니다. 웰당 2mL의 배지에 최소 6 x 10⁵셀(각각 2 x 10,³셀 구의 경우) 및 최대 6 x 10⁶셀(각각 2 x 10,⁴셀 구의 경우)을 추가합니다. 이 범위 내에서 특정 밀도의 실행 가능한 구의 경우 정의된 양의 셀을 사용하고 300으로 나누어 구당 셀 수를 계산합니다. 원하는 경우 대안적인 구 형성 방법 및 도구를 사용할 수도 있습니다. 허용 가능한 세포 밀도 범위에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
   3. 세포가 향후 2일 동안 마이크로웰 플레이트 내에 조밀하게 채워진 구체로 자체 조립되도록 합니다(그림 1A). 배양물이 황변하는 경우 미디어의 50%를 교체합니다.
      메모: 구체를 방해하지 않도록 매체를 제거 및 추가할 때 절반의 매체와 피펫만 부드럽게 교환하십시오. 구체는 마이크로 웰에서 들어 올려져 더 높은 힘으로 함께 융합 될 수 있습니다.
   4. 2일 후, 1,000μL 마이크로피펫으로 마이크로웰에서 구체를 부드럽게 제거합니다(그림 2D). 매체로 마이크로웰 바닥에 가볍게 힘을 가하여 추가로 부착된 구체를 제거합니다. 구체를 15mL 원뿔형 튜브에 가라앉히고 기존 배지를 흡인하고 새 배지를 추가합니다.
4. 3D 구를 형성하기 위해 스피너 플라스크 바이오리액터 시스템을 설정합니다.​
   1. 70% 에탄올로 마그네틱 교반 플레이트의 표면을 청소하고 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 개별 스피너 플라스크를 오토클레이브하여 살균합니다.
   2. 각 스피너 플라스크에 최소 50–60mL 매체가 있는 구체를 추가합니다(그림 2D, 삽입 사진). 60rpm으로 설정된 자기 교반 플레이트에 플라스크를 놓습니다. 데이터 수집 준비가 될 때까지 스피너 플라스크에서 구체를 배양합니다.
      메모: 시냅스 형성을 위해 최소 3주의 배양이 필요합니다.

결과

그림 1: 생명공학적 3D 신경 구체의 체계적이고 재현 가능한 생성. (A) 마이크로웰(μ-well) 배양 플레이트는 원하는 밀도와 뉴런 대 성상세포 비율의 3D 신경 구체를 체계적이고 사용자 지정된 방식으로 형성하여 일관된 크기와 모양을 생성하는 데 사용됩니다. 이미지는 구 형성 1일 후에 표시됩니다. 스케일 바 = 200μm. (B) 시작 셀 밀도 범위(마이크로웰당 4 x 10³에서 2 x 10,⁴ 셀)는 다양한 크기의 구체를 생성합니다. 마이크로웰 플레이트가 없는 경우, hPSC는 결합되어 일주일 후에 직경이 확산 한계를 초과하는 훨씬 더 크고 불균일한 응집체를 형성합니다(n = 그룹 및 시점당 6-...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6웰 플레이트	피셔 사이언티픽	08-772-1B
15ml 원뿔형 튜브	Olympus 플라스틱	28-101
아카쿠타아제	시그마	A6964-100ML	분리 솔루션
AggreWell 플레이트	스템셀 기술	34850
Anti-Adherence 헹굼 솔루션	스템셀 기술	7010	마이크로웰 플레이트에 대한 세포 접착 방지
안티/안티	써모피셔	15240062
나27	써모피셔	17504044	미디어 보충 자료
BrainPhys 뉴런 배지	스템셀 기술	5790	신경생리학적 기초 매체 대안
DMEM/F12	써모피셔	제10565-042	GlutaMAX 보충제 함유
재질 보기 DMH-1	스템셀 기술	73634	위험: 삼키면 유독합니다. 작업 농도 : 2 uM
당나귀 세럼	Lampire 생물학 연구소	7332100	작동 농도: 1차 차단 버퍼에서 5%, 2차 차단 버퍼에서 1%
독시사이클린 염산염(Dox)	시그마	D3072-1ml	위험: 임산부에게 유독합니다. 작동 농도 : 2ug / mL
표피 성장 인자(EGF)	페프로텍	AF-100-15	작업 농도 : 10 ng / mL
섬유아세포 성장 인자-2 (FGF)	페프로텍	100-18B	작업 농도 : 10 ng / mL
혈구계 또는 자동 세포 계수기	생명 기술	AMQAX1000
Matrigel 멤브레인 매트릭스	코 닝	제354230	ECM 코팅 솔루션. 작업 농도 : 80 ug / ml. 얼음 위에서 준비하고 피펫, 튜브 및 미디어가 미리 냉각되었는지 확인하십시오.
MEA 2100 시스템	멀티채널 시스템	MEA2100
로키나아제 억제제 Y27632- (Y)	토크리스	1254	작업 농도 : 10 uM
SB431542	스템셀 기술	72234	작업 농도 : 2 uM
스피너 플라스크	피셔 사이언티픽	4500-125
T25 배양 플라스크	Olympus 플라스틱	25-207	벤티드 캡
트리판 블루	인비트로젠	T10282

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