골수 기질 세포에서 Schwann 세포 유사 세포 생성

초록

출처: Tsui, Y., et al. 성숙한 슈반 세포 생성을 위한 소스로서의 골수 유래 전구 세포의 저산소 전조건화.J. Vis. 특급 (2017년)

이 동영상은 다분화능 골수 기질 세포(BMSC)에서 슈반 세포 유사 세포를 얻는 방법을 보여줍니다. 초기에 BMSC는 저산소증(hypoxia) 치료를 받은 후 신경 전구 세포(neuronal progenitor cell)로 직접 분화합니다. 그 후, 특정 배지 및 배양 조건을 사용하여 이러한 전구 세포가 슈반 세포와 같은 세포로 형질전환을 유도합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 쥐 MSC 배양 준비

1. 대퇴골에서 MSC 채취
   1. 모든 해부 도구(즉, 미세 해부 가위, 끝이 뭉툭한 절단 가위, 톱니가 있는 집게)를 사용하기 전에 최소 2시간 동안 180°C에서 오토클레이브합니다.
   2. 15% 소 태아 혈청(FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신(P/S, 1% v/v)이 보충된 최소 필수 배지인 알파 변형(αMEM)으로 구성된 MSC 성장 배지를 준비합니다.
   3. 펜토바르비톤 과다 복용(체중 240mg/kg, 복강내)으로 젊은 수컷 Sprague Dawley 쥐(체중 200-250g)를 희생합니다.
      메모: 다른 쥐의 골수 샘플은 별도로 처리해야 합니다.
   4. 희생된 동물을 누운 자세로 놓습니다. 복부와 하지를 70% 에탄올로 깨끗이 씻어주세요.
   5. 미세한 절개 가위와 집게를 사용하여 허벅지 내측 위의 피부와 피하 조직을 제거합니다. 대퇴골이 노출될 때까지 허벅지 근육을 둘레로 제거합니다. 무릎과 고관절이 보일 때까지 근위와 원위부로 이 작업을 계속합니다. 끝이 뭉툭한 절단 가위를 사용하여 엉덩이와 무릎 관절을 통해 대퇴골을 관절을 분리합니다.
      메모: 이 단계에서 골수를 노출시키기 위해 대퇴골을 절제하지 마십시오. 추가 처리를 위해 온전한 대퇴골을 층류 조직 배양 후드로 옮깁니다.
   6. 끝이 뭉툭한 절단 가위를 사용하여 형이상학을 통해 대퇴골의 원위부와 근위부 끝을 횡단합니다.
   7. 70μm 세포 여과기를 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓습니다. 인산염 완충 식염수(PBS, 10mM Na₂HPO₄, pH 7.4)가 함유된 21G, 10mL 주사기를 노출된 대퇴관에 삽입하고 반복적인 세척을 통해 골수 함량을 원뿔관으로 플러시합니다.
      메모: 각 대퇴골을 세척하는 데 약 20mL의 PBS가 사용됩니다. 플러시된 내용물의 색상이 핏자국이 있고 탁한 상태로 유지되면 더 많은 부피를 사용할 수 있습니다.
   8. 480 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 상층액을 버립니다. 세포 펠렛을 10mL의 MSC 성장 배지에 재현탁합니다. 세포를 10cm 조직 배양 접시에 접시로 고정합니다. 조직 배양 접시를 세포 배양기(37°C, 5% CO₂)에 넣습니다. 도금 초기일을 day 0.
      로 기록합니다. 메모: 원심분리와 관련된 모든 단계에서 최대 감속을 위해 브레이크를 설정하십시오.
2. MSC 식민지 형성 및 확장
   메모: 이 프로토콜은 골수 구멍 내에서 MSC를 선택하기 위해 조직 배양 플라스틱 순응도에 의존합니다. 골수 함량은 2일 동안 조직 배양 플라스틱에 부착할 수 있습니다.
   1. 2일차에 PBS 10mL로 배양 플레이트를 세 번 헹구어 비부착성 세포를 제거합니다. 헹굼 후 PBS를 10mL의 MSC 성장 배지로 교체합니다. PBS로 세포를 세척하고 3일마다 MSC 성장 배지로 보충합니다.
      메모: MSC 집락은 6-7일째까지 볼 수 있어야 합니다(그림 1A).
   2. 10일째까지 성장 배지를 제거하고 PBS로 세포를 헹궈 세포를 계대에 계대시킵니다. 1.5mL의 재조합 효소 세포 해리 시약을 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. MSC 성장 배지 3mL를 첨가하여 반응을 중화합니다. 분리된 세포를 250 x g에서 5분 동안 원심분리하여 수집합니다.
   3. PBS에서 적절하게 희석한 후 혈구계를 사용하여 펠릿 내의 세포를 정량화합니다.
   4. 40,000 cells/^cm2의 밀도로 계대배양된 세포를 MSC 성장 배지의 10cm 배양 플레이트에 시드합니다.
      메모: 쥐의 MSC는 통과 후 2일 이내에 80-90% 합류점에 도달해야 합니다(그림 1B). 세포는 1.2.2단계에서 설명한 대로 최대 8개의 계대에 대해 계대배양할 수 있습니다. MSC는 면역세포화학(immunocytochemistry)과 삼계통 분화 능력을 사용하여 특성화할 수 있습니다(그림 2). 3계와 8단계 사이의 MSC 배양만이 후속 저산소 전처리 및 신경 전구 농축의 대상이 됩니다. 계대 수가 더 많은 MSC는 편평한 형태학(그림 1C)을 채택하고 충분한 신경 전구세포를 생성하지 않습니다. 이러한 문화는 버려야 합니다.

2. 인간 BMSC 배양 준비

1. 흡인 인간 골수 1mL를 MSC 성장 배지 9mL로 희석하고 10cm 조직 배양 접시에 세포를 플레이트합니다. 세포 배양기(37°C, 5% CO₂)에서 배양을 유지합니다.
2. 2일 후에 배지를 제거하고 10mL의 PBS로 배양액을 세 번 부드럽게 헹구어 비부착성 세포를 제거합니다. 최종 헹굼 후 PBS를 제거하고 10mL의 MSC 성장 배지로 교체합니다. PBS 헹굼 후 배양 3일마다 성장 배지를 보충합니다.
   메모: MSC 군집은 6-7일째까지 볼 수 있어야 합니다. 군체의 수는 피험자마다 다를 수 있습니다.
3. 1.2.2단계에서 설명한 대로 10일째에 세포를 계대절시킵니다. PBS에서 적절하게 희석한 후 혈구계를 사용하여 펠릿 내의 세포를 정량화합니다. 40,000 cells/cm² 밀도로 배양된 세포를 MSC 성장 배지의 10cm 배양 플레이트에 시딩합니다.
   메모: 인간 MSC(그림 1D)는 쥐 MSC와 유사한 형태를 보이며 배양 후 2일 이내에 80-90% 합류점에 도달해야 합니다. 이들은 면역세포화학(immunocytochemistry)과 삼계통 분화 능력을 사용하여 특성화해야 합니다. 쥐 MSC와 마찬가지로, 3계와 8단계 사이의 인간 MSC는 후속 저산소 전조건화 및 신경 전구 세포 농축의 대상이 됩니다.

3. 저산소 전처리

1. 링 cl을 해제한 후 저산소증 챔버 구성 요소(즉, 베이스, 뚜껑, 트레이)를 분해합니다.amp 개별 부품을 70% 에탄올로 청소합니다. 챔버 구성 요소를 층류 조직 배양 후드 내에 배치하여 15분 동안 자외선 아래에서 멸균합니다.
2. 저산소 전처리 전에 배지를 제거하고 쥐와 인간 MSC 배양물(섹션 1 및 2)을 10mL의 PBS로 헹굽니다. PBS를 25mM HEPES.
   가 보충된 10mL의 MSC 성장 배지로 교체합니다. 메모: 10cm 접시에서 배양된 MSC는 저산소 전처리 전에 80-90% 포화도에 도달해야 합니다.
3. 저산소증 챔버 안에 배양 접시를 놓습니다. 챔버 구성 요소를 재조립하고 링 cl을 조입니다.amp. 99% N₂/1% O₂의 가스 혼합물을 10L/min의 유속으로 5분 동안 챔버로 플러시합니다.
4. 가스 누출이 없도록 저산소증 챔버의 연결 끝을 밀봉하십시오. 챔버를 셀 인큐베이터(37°C, 5% CO₂) 내부에 16시간 동안 놓습니다.
5. 저산소 전처리가 완료되면 후속 신경 전구 농축 배양을 준비하기 위해 챔버에서 배양액을 제거합니다.

4. 신경 전구 농축 배양

1. B27(2% v/v), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF, 20ng/mL), 표피 성장 인자(EGF, 20ng/mL) 및 P/S(1% v/v)가 보충된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지/Ham의 영양 혼합물 F12(DMEM/F12)로 구성된 신경 전구 배지를 준비합니다.
2. 1.2.2단계에서 설명한 대로 저산소 전처리 랫드/인간 MSC를 분리합니다. 분리된 세포를 250 x g에서 5분 동안 원심분리하여 수집합니다. PBS에서 적절하게 희석한 후 혈구계를 사용하여 펠릿 내의 세포를 정량화합니다.
3. 신경전구배지(neural progenitor medium)에 세포를 재현탁시키고 6,000 cells/cm2의 밀도로 부착성이 낮은 6웰 플레이트에 파종합니다. 배양액을 세포 배양기(37°C, 5% CO₂)에 12일 동안 넣습니다. 3일마다 신경전구배지의 75%를 보충합니다.
   메모: 크기가 큰 비부착 세포 클러스터는 6-7일까지 관찰해야 합니다. 10-12일째에는 직경이 100μm≥ 신경구를 관찰할 수 있습니다(그림 3). 저산소성 프리컨디셔닝 MSC는 정상 산소 조건에서 배양된 MSC보다 더 많은 신경구를 생성해야 합니다.
4. 12일차에 신경구를 10mL 피펫으로 흡인하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮겨 수집합니다. 250 x g에서 5분 동안 신경구를 원심분리합니다.
   메모: 신경구는 nestin 및 GFAP와 같은 신경 전구 마커에 대해 12일째에 특성화할 수 있습니다.

5. 슈반세포와 같은 세포의 생성

1. β-Heregulin(100ng/mL), bFGF(10ng/ml), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF-AA, 5ng/mL), FBS(10%) 및 P/S(1% v/v)가 보충된 αMEM으로 구성된 신경교 유도 배지를 준비합니다.
2. 섹션 4에서 준비된 신경구를 PDL/라미닌 코팅된 6-웰 플레이트에서 웰당 1.5mL의 신경교세포 유도 배지에서 cm²당 5-10구의 밀도로 플레이트화합니다. 세포를 PBS.
   로 헹군 후 2일마다 신경교세포 유도 배지를 교체하십시오. 메모: 파종된 신경구의 세포는 2일차까지 바깥쪽으로 이동하는 것으로 보입니다. 7일째가 되면 철새 세포는 가늘어지는 모양을 보이며 Schwann 세포 마커 p75 neurotrophin receptor (p75) 및 S100β에 대한 면역 양성을 나타내야 합니다. 이러한 셀을 SCLC라고 합니다.

결과

그림 1: MSC 콜로니의 형성. 상당한 크기의 MSC 콜로니는 골수 세포를 조직 배양 플라스틱에 도금한 후 6-7일 후에 볼 수 있어야 합니다. 쥐 MSC 군집의 대표적인 이미지가 표시되며(A), 인간 군체는 유사한 모습을 보여줍니다. 군체는 10일째에 통과할 수 있습니다. 더 높은 배율에서 볼 때, 쥐(B)와 인간(D) MSC는 모두 통과 후 특징적인 섬유아세포와 같은 형태를 나타냅니다. 높은 통과 수를 위해 유지되는 MSC는 평평한 사각형 형태(C)를 가지므로 폐기해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
α멤	시그마알드리치	M4526
DMEM/F12	써모피셔 사이언티픽	제12400-024
FBS(증권 시세	바이오세라	FB-1280/500
나27	써모피셔 사이언티픽	제17504-001
표피 성장 인자(EGF)	써모피셔 사이언티픽	PHG0313
염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)	페프로텍	100-18B/100UG
혈소판 유래 성장 인자-AA (PDGF-AA)	페프로텍	100-13ᅡ
헤레굴린 베타-3, EGF 도메인(β-Her)	밀리포어	01-201
폴리-D-라이신(PDL)	시그마알드리치	P7886-1G
라미닌	써모피셔 사이언티픽	23017015
페니실린 / 스트렙토마이신 (P/S)	써모피셔 사이언티픽	15140-122
TrypLE 익스프레스	써모피셔 사이언티픽	제12604-013
부착 배양을 위한 10cm 플레이트	증권 시세	93100	MSC 선택에 사용
접착 배양을 위한 6웰 플레이트	증권 시세	92006	계량 배양 후 MSC의 확장에 사용
비부착성 배양을 위한 UltraLow 6-well 플레이트	코 닝	3471	신경 전구 세포 농축에 사용
안티 휴먼 CD90 (Thy-1)	BD 바이오사이언스	555593
안티 휴먼 CD73	BD 바이오사이언스	550256
안티 휴먼 / 쥐 STRO-1	R&D 시스템	MAB1038
안티 휴먼 CD45	BD 바이오사이언스	555480
저산소증 챔버	빌럽스-로텐베르크	마이크-101
HEPES 버퍼	시그마알드리치	H4034-100지
안티 휴먼 네스틴	R&D 시스템	MAB1259
안티 랫 CD90 (Thy-1)	BD 바이오사이언스	554895
안티 랫 CD73	BD 바이오사이언스	551123
안티 쥐 네스틴	BD 바이오사이언스	MAB1259
안티 랫 CD45	BD 바이오사이언스	554875
안티 S100β	다코	Z031101
안티 p75	밀리포어	MAB5386
안티 GFAP	시그마알드리치	G3893
안티 클래스 III- 베타 튜불린 (Tuj-1)	코밴스	MMS-435P
반(反)휴먼 핵	밀리포어	MAB1281

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