DRG 뉴런의 분리 및 Schwann 세포 전구체와의 공동 배양을 통해 Schwann 세포 생성

초록

출처: Tsui, Y, et al. 성숙한 슈반세포 생성을 위한 소스로서의 골수 유래 전구 세포의 저산소 전조건화. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 쥐 배아에서 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런을 분리하고 슈반 세포 전구체와 공동 배양하여 성숙한 슈반 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다. 분리된 DRG는 뉴런과 신경교세포를 분리하기 위해 처리됩니다. 분리된 세포를 배양하여 뉴런을 정제한 다음, 공동 배양 배지에서 슈반 세포 유사 세포(SCLC)와 공동 배양합니다. DRG 뉴런과의 상호 작용은 SCLC가 슈반 세포로 성숙하도록 유도합니다.

프로토콜

DRG 뉴런과의 공동 배양을 통한 운명 커밋 슈반 세포 생성

1. 정제 된 쥐 DRG 뉴런의 준비

1. 모든 해부 도구(즉, 해부 가위, 집게, 현미해부 집게 2개, 현미해부 가위)를 사용하기 전에 최소 2시간 동안 180°C에서 오토클레이브합니다.
2. 6웰 조직 배양 플레이트를 폴리-D-라이신(PDL, PBS의 경우 10μg/mL)으로 4°C에서 밤새 코팅합니다. PDL을 제거하고 웰당 1.5m의 PBS로 헹굽니다.
3. 37°C에서 2시간 동안 라미닌(PBS의 경우 10μg/mL)으로 플레이트를 코팅합니다. 웰당 1.5mL의 PBS로 플레이트를 헹굽니다.
4. B27(2% v/v), L-글루타민(1% v/v), 신경 성장 인자(NGF, 20ng/mL) 및 페니실린/스트렙토마이신(P/S, 1% v/v)이 보충된 신경 기저 배지로 구성된 DRG 뉴런 유지 배지를 준비합니다.
5. B27(2% v/v), L-글루타민(1%), 신경 성장 인자(NGF, 20ng/mL), P/S(1%), 플루오로데옥시우리딘(FDU, 10μg/mL) 및 우리딘(10μg/mL)이 보충된 신경 기저 배지로 구성된 DRG 뉴런 정제 배지를 준비합니다.
6. 임신 일 14-15에 임신 한 쥐를 펜토 바르비탈 과다 복용 (240 mg / kg 체중, 복강 내)으로 희생시킵니다.
7. 희생 된 동물을 누운 자세로 놓습니다. 70% 에탄올로 복부를 철저히 청소하십시오.
8. 미세한 해부 가위와 집게를 사용하여 동물의 하복부를 세로로 자릅니다. 해부 가위를 사용하여 자궁을 확인하고 제거합니다. 자궁벽을 절개하여 배아를 노출시키고 추출합니다. 배아를 PBS로 채워진 10cm 배양 멸균 접시에 옮깁니다. 배양 접시를 얼음 위에 놓습니다.
9. 해부할 배아를 PBS(실온)로 채워진 10cm 크기의 멸균 배양 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 배아를 엎드린 자세로 두십시오.
   메모: 희끄무레한 척수와 부착된 DRG는 반투명한 피부를 통해 배아의 등쪽 측면에서 볼 수 있습니다.
10. 척수의 양쪽을 따라 미세 해부 겸자를 삽입하고 둔기 절제를 사용하여 척수를 주변 연조직과 분리하기 시작합니다. 목 구멍과 꼬리 그루터기를 따라 미세 해부 집게를 사용하여 동물로부터 척수를 절단합니다. 탯줄의 복부 부분을 더 둔하게 해부하여 주변 연조직에서 탯줄을 제거합니다.
11. 미세 절개 겸자를 사용하여 해제된 척수의 등쪽 쪽에 남아 있는 연조직을 제거합니다.
    메모: 이 단계에서는 척수, 신경근 및 부속된 DRG만 남아 있어야 합니다.
12. 미세해부 겸자를 사용하여 연결 신경근에서 개별 DRG를 분리합니다. 1mL 팁에 부착된 피펫 펜을 사용하여 DRG를 PBS.
    가 들어 있는 1.5mL 멸균 원심분리 튜브로 옮깁니다. 메모: 각 1.5mL 튜브에 대해 최대 100개의 DRG를 수용할 수 있습니다.
13. DRG를 250 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 재조합 효소 세포 해리 시약(튜브당 200μL)에 재현탁합니다. 10분 동안 (37 °C, 5% CO₂) 배양합니다. DRG를 250 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 DRG 뉴런 유지 배지에 재현탁합니다. 200 μL 피펫 팁을 사용하여 부드러운 분쇄로 펠릿을 해리합니다. 적절한 희석 후 혈구계를 사용하여 펠릿 내의 세포를 정량화합니다.
14. 웰당 1.5mL의 DRG 뉴런 유지 배지에 있는 PDL/라미닌 코팅된 6-웰 플레이트에 5,000 cells/^cm2의 밀도로 세포를 시딩합니다. 배양 2일 후 DRG 뉴런 유지 배지를 제거하고 PBS로 헹구고 DRG 뉴런 정제 배지로 교체합니다.
    메모: 각 정제 주기에 대해 DRG 배양액을 정제 배지로 2일 동안 처리한 후 유지 배지에서 1일 동안 배양합니다. 3-4회의 정제 주기 후에 모든 내인성 신경교세포의 제거가 예상됩니다. 이 작업은 약 14일 정도 소요됩니다. 정제된 배양액은 뉴런 마커 TUJ1에 대해 양성 반응을 보이며 S100β 발현에는 없습니다(그림 1).

2. 슈반 세포와 같은 세포의 생성

1. β-Heregulin(100ng/mL), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF, 10ng/ml), 혈소판 유래 성장인자(PDGF-AA, 5ng/mL), 소태아 혈청(FBS, 10%) 및 P/S(1% v/v)가 보충된 αMEM(Minimum essential medium Eagle(MEM), 알파 변형)으로 구성된 신경교유도 배지를 준비합니다.
2. PDL/라미닌 코팅된 6-웰 플레이트의 섹션 4에서 준비된 신경구를 웰당 1.5mL의 신경교세포 유도 배지에서 cm2당 5-10개의 구체 밀도로 플레이트화합니다. PBS로 세포를 헹구는 후 2일마다 신경교세포 유도 배지를 교체하십시오.
3. 참고: 파종된 신경구의 세포는 2일차까지 바깥쪽으로 이동하는 것으로 보입니다. 7일째가 되면 철새 세포는 가늘어지는 모양을 보이며 Schwann 세포 마커 p75 neurotrophin receptor (p75) 및 S100β7에 대한 면역 양성을 나타내야 합니다. 이러한 셀을 SCLC라고 합니다.

3. DRG 뉴런과 SCLC의 공동 배양

1. DRG 뉴런 유지 배지(단계 1.1.4)와 신경교 유도 배지(단계 1.2.1)로 구성된 공동 배양 배지를 1:1 부피 대 부피 비율로 준비합니다.
2. FBS(5%), β-Heregulin(10ng/mL) 및 P/S(1% V/v)가 보충된 Dulbecco의 Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12))로 구성된 Schwann 세포 유지 배지를 준비합니다.
3. 7일차 SCLC에서 배양 배지를 제거하고 PBS로 헹구고 0.5mL/웰의 재조합 효소 세포 해리 시약으로 37°C에서 5분 동안 배양합니다. SCLC를 공동 배양 배지에 재현탁합니다.
4. 적절한 희석 후 혈구계를 사용하여 세포를 정량화합니다.
5. 1,000 cells/cm²의 밀도로 정제된 DRG 뉴런 배양액에 SCLC를 파종합니다. 14일 동안 공동 배양을 유지하고 2일마다 배지를 교체합니다.
   메모: 공동 배양 중에 SCLC는 성숙한 슈반 세포의 전형적인 방추형과 같은 형태를 획득했습니다(그림 2). 이 세포는 성장 인자의 철회 후에도 표현형을 유지하며 in vitro 및 in vivo에서 축삭을 수초화할 수 있습니다. Schwann 세포 마커(즉, p75 및 S100β)의 양성 여부는 면역형광으로 모니터링해야 합니다.
6. 공동 배양이 완료되면 계대 운명에 투입된 Schwann 세포. 웰당 0.5mL의 해리 시약을 사용합니다. 적절한 희석 후 혈구계를 사용하여 세포를 정량화합니다.

결과

그림 1 : 정제된 랫드 DRG 네트워크 구축. 정제된 DRG 네트워크는 항유사분열제인 FDU 및 우리딘(A)으로 펄스 처리 후 구축됩니다. S100β를 발현하는 내인성 신경교세포(B)가 없는 신경암 네트워크는 SCLC와 공동 배양할 준비가 되어 있습니다. 스케일 바 = 100μm.

그림 2: DRG 뉴런과의 공동 배양을 통한 골수 유래 슈반 세포 생성.정제된 DRG 뉴런 및 인간 SCLC와 2주간의 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
α멤	시그마알드리치	M4526
DMEM/F12	써모피셔 사이언티픽	제12400-024
Neurobasal 배지	써모피셔 사이언티픽	제21103-049
FBS(증권 시세	바이오세라	FB-1280/500
나27	써모피셔 사이언티픽	제17504-001
표피 성장 인자(EGF)	써모피셔 사이언티픽	PHG0313
염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)	페프로텍	100-18B/100UG
신경 성장 인자(NGF)	밀리포어	NC011
혈소판 유래 성장 인자-AA (PDGF-AA)	페프로텍	100-13ᅡ
헤레굴린 베타-3, EGF 도메인(β Her)	밀리포어	01-201
우리딘	시그마알드리치	U3003
5-Fluro-2' - 데옥시우리딘(FDU)	시그마알드리치	F0503
폴리-D-라이신(PDL)	시그마알드리치	P7886-1G
라미닌	써모피셔 사이언티픽	23017015
글루타맥스	써모피셔 사이언티픽	35050061
페니실린 / 스트렙토마이신 (P/S)	써모피셔 사이언티픽	15140-122
TrypLE 익스프레스	써모피셔 사이언티픽	제12604-013
부착 배양을 위한 10cm 플레이트	증권 시세	93100	조직 배양 순응도에 의한 MSC 선택에 사용
접착 배양을 위한 6웰 플레이트	증권 시세	92006	계량 배양 후 MSC의 확장에 사용
비부착성 배양을 위한 UltraLow 6-well 플레이트	코 닝	3471	신경 전구 세포 농축에 사용
저산소증 챔버	빌럽스-로텐베르크	마이크-101
HEPES 버퍼	시그마알드리치	H4034-100지

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