하이드로겔 마이크로 컬럼 내에서 성상세포 스캐폴드를 생성하는 In Vitro 방법

초록

출처: Katiyar, K. S., et al. 발달 메커니즘을 요약하고 신경계 재생을 촉진하기 위해 3차원 조직 엔지니어링 정렬 성상세포 네트워크. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 하이드로겔 마이크로 컬럼 내에서 3차원 성상세포 골격을 생성하는 방법을 보여줍니다. 미세기둥의 내부는 콜라겐으로 코팅되어 있습니다. 성상세포(astrocyte)가 도입되어 콜라겐에 부착하고 추가 배양을 통해 3차원 골격으로 자가 조립됩니다.

프로토콜

1. 아가로스 하이드로겔 마이크로 컬럼 개발

1. 아가로스 3g의 무게를 측정하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 100mL가 들어 있는 멸균 비커로 옮겨 아가로스 3% 중량/부피(w/v) 용액을 만듭니다. 비커에 멸균 마그네틱 바를 추가하고 열판/교반기 표면에 놓습니다. 다음 단계에서 내용물이 증발하지 않도록 비커를 덮은 상태로 유지하십시오.
2. 아가로스와 DPBS를 100°C의 온도로 가열하고 60-120rpm으로 저어줍니다. 필요에 따라 이러한 설정을 조정하고 용액이 초기에 불투명에서 아가로스가 완전히 용해되었음을 나타내는 명확한 모양으로 변경됨에 따라 용해 프로세스의 진행 상황을 지속적으로 모니터링합니다.
   주의: 뜨거운 비커와 용액이 뜨겁습니다!
3. 아가로스 용액을 가열하고 저어주면서 빈 10cm 페트리 접시 4개를 꺼내고 그 중 2개에 DPBS 20mL를 추가합니다. 침술(직경: 300μm, 길이: 40mm), 유리 마이크로리터 모세관(직경: 701.04μm, 길이: 65mm, 용량: 25.0μL) 및 전구 디스펜서를 생물 안전 캐비닛 내부에 넣습니다. 액체 아가로스 용액이 제거되면 약 50°C에서 일정한 가열을 유지하고 아가로스가 겔화되지 않도록 저어줍니다.
4. 구근 디스펜서의 하단 구멍에 침 바늘을 삽입합니다. 외부에 노출된 바늘 위에 모세관 튜브를 삽입합니다. 모세관의 일부를 전구 디스펜서 실린더의 고무 부분에 삽입하여 모세관 튜브를 고정합니다.
5. 마이크로피펫으로 액체 아가로스 1mL를 빈 페트리 접시 표면으로 옮기고 모세관의 한쪽 끝을 아가로스와 수직으로(바늘이 삽입된 상태로) 놓고 전구 디스펜서의 고무 캡을 안쪽으로 꼬집습니다. 전구 디스펜서 캡의 압력을 천천히 해제하여 아가로스를 모세관 안으로 끌어들입니다.
   메모: 액체 아가로스를 모세관 내로 옮기는 것은 신속하게 수행되어야 합니다. 액체 아가로스를 페트리 접시 표면에서 충분한 시간(약 60초) 동안 냉각시키면 겔화되기 시작하여 모세관 을 따라 아가로스가 적절하게 흡입되는 것을 방지합니다.
6. 각 전구-튜브-바늘 어셈블리를 무료 페트리 접시에 넣고 모세관 내부의 아가로스 젤이 5분 동안 응고되도록 합니다. 전구 디스펜서 실린더의 고무 마개에서 손으로 모세관 튜브를 조심스럽게 당겨 바늘과 아가로스 젤을 튜브 내부의 제자리에 둡니다.
7. 침술을 모세혈관에서 천천히 당겨 수동으로 추출합니다. 새로 응고된 아가로스 실린더도 이 과정에서 침 밖으로 미끄러져 나오지만 여전히 침을 둘러싸고 있습니다. 멸균 집게 끝으로 침술을 따라 마이크로 컬럼을 부드럽게 밀어 끝으로 움직입니다. 열린 DPBS가 포함된 페트리 접시 위에 바늘을 놓고 집게로 마이크로 컬럼을 DPBS에 밀어 넣습니다.
   메모: 침을 제거한 후 아가로스 마이크로 컬럼이 유리 모세관 내에 남아 있으면 25mm 게이지 바늘을 사용하여 아가로스 마이크로 컬럼을 모세관 밖으로 천천히 밀어 넣고 DPBS로 접시에 넣습니다.
8. 핫 비드 살균기를 사용하여 미세 메스나 집게를 살균합니다. 4g의 아가로스 무게를 측정하고 100mL의 DPBS로 옮겨 4% w/v 아가로스를 만듭니다. 1.2단계에서 설명한 대로 가열하고 저어주어 투명한 4% 액체 아가로스 용액을 얻습니다. 다음 단계를 통해 용액의 가열 및 교반을 유지하십시오.
9. 마이크로 컬럼이 포함된 페트리 접시를 해부 후드로 옮기고 미세한 집게가 있는 마이크로 기둥을 빈 페트리 접시로 이동합니다. 시각적 안내를 위해 입체경을 활용하고 마이크로 메스를 사용하여 마이크로 컬럼을 원하는 길이로 자릅니다. 양쪽 끝을 잘라 수평에서^45o 각도로 비스듬한 말단을 형성하여 ECM(extracellular matrix) 및 세포 추가 중에 마이크로 컬럼을 쉽게 처리할 수 있습니다.
10. 동일한 페트리 접시에 있는 3개의 마이크로 컬럼에 대해 이전 단계를 반복하고 각 실린더 사이에 <3mm의 간격을 두고 4개의 구조를 병렬로 정렬합니다. 50μL의 4% 아가로스 용액을 마이크로피펫으로 로드하고 마이크로 컬럼 어레이 위에 줄무늬/액체 라인을 부어 구조체를 4개의 그룹(이하 "마이크로 컬럼 보트"라고 함)으로 연결하고 번들링합니다. 구조체 사이의 거리를 최소화하고 아가로스를 가는 선으로 빠르게 추가하여 내부를 막을 수 있는 마이크로 컬럼 끝으로 4% 아가로즈의 이동을 피하십시오.
    메모: 4개의 마이크로 기둥 그룹을 "보트"로 배열하는 것은 astrocytic 골격을 제작할 필요가 없습니다. 그럼에도 불구하고 보트는 제조 공정을 서두르고 이후 단계에서 마이크로 컬럼을 이동하고 처리하는 보다 안전한 방법을 제공하는 역할을 합니다.
11. 마이크로 컬럼 보트를 1-2분 동안 식혀 첨가된 4% 아가로스가 겔화될 수 있도록 합니다. 4% 아가로스를 연결하여 미세한 집게로 마이크로 컬럼 보트를 집고 마이크로 컬럼을 1.1.3단계에서 준비한 다른 DPBS 함유 페트리 접시로 이동합니다. 원하는 대로 나머지 마이크로 컬럼으로 더 많은 보트를 제작합니다.
12. 마이크로 컬럼 및/또는 보트가 들어 있는 페트리 접시를 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 자외선(UV)에 노출시켜 30분 동안 살균합니다.
    주의: UV에 노출되지 않도록 적절한 보호구를 착용하십시오.
13. 마이크로 컬럼 보트와 함께 접시를 4°C의 DPBS에 보관하며, ECM 첨가 및 세포 도금이 즉시 발생하지 않는 경우 최대 1주일까지 보관합니다. 이 기간 동안 구조가 사용되지 않는 경우 마이크로 컬럼 제작 단계를 반복합니다.

2. 일차 세포 배양 및 분리

1. 새끼 쥐로부터 피질 성상세포 분리
   1. 다음 단계를 준비하기 위해 20mL의 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)을 절개된 조직의 저장소 역할을 할 4개의 10cm 페트리 접시에 추가합니다. 모든 접시를 얼음에 보관하십시오. 깨끗한 수술용 가위, 집게, 마이크로 주걱 및 마이크로 메스를 뜨거운 구슬 살균기로 소독합니다.
   2. 37°C에서 HBSS에서 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 0.15mg/mL 데옥시리보뉴클레아제(DNase) I로 0.25% 트립신을 예열합니다. 또한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)과 Ham's F-12 Nutrient Mixture 및 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 구성된 성상세포 배양 배지를 37°C에서 예열합니다.
   3. 출생 후 0일차 또는 1일차 Sprague-Dawley 새끼 쥐를 저체온 상태에 노출시켜 마취하고 참수로 안락사시킵니다. 눈 앞쪽의 주둥이에 19mm 게이지 바늘을 꽂아 머리를 스테이지에 고정합니다.
   4. 메스로 목 밑에서 눈 바로 뒤까지 중간 뒤쪽에서 앞쪽으로 절개합니다. 눈 바로 뒤에서 아래쪽으로 측면으로 절개를 하여 T자 모양을 형성합니다. 가는 집게를 사용하여 두개골 피부/두개골을 옆으로 당겨 빼냅니다.
   5. 집게의 한 갈래를 동물의 입에 넣고 다른 갈래를 바깥쪽 표면에 놓아 주둥이(위를 향함)로 머리를 잡습니다. 멸균 마이크로 주걱으로 뇌를 제거하고 식힌 HBSS로 채워진 페트리 접시 중 하나에 넣습니다. 이 페트리 접시를 얼음 위에 올려 놓은 직후와 사용할 때를 제외하고는 항상 얼음 위에 놓으십시오.
   6. 이전에 -20°C에서 보관했던 화강암 블록을 해부 후드 내부의 입체경 아래에 배치합니다. 뇌 조직이 있는 페트리 접시를 화강암 블록의 표면에 놓아 해부 절차 동안 낮은 온도를 유지합니다. 다음 단계에서 스테레오스코프를 시각적 지침으로 사용합니다.
   7. 후각구가 손상되지 않으면 집게나 마이크로 메스로 절단하여 추출합니다. 또한 마이크로 메스를 사용하여 소뇌를 제거하고 두 대뇌 반구를 분리하는 정중선 절개를 만듭니다. 집게로 반구를 신선하고 차가운 HBSS가 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다.
   8. 미세한 메스로 반구 내부로부터 중뇌 구조를 해부하여 분리된 피질만 얻습니다. 가는 집게를 사용하여 피질 조직에서 시트 같은 구조인 수막을 벗겨내고 분리된 피질을 차가운 HBSS가 있는 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 다음 단계에서 트립신 작용을 위한 표면적을 늘리기 위해 마이크로 메스를 사용하여 조직을 다집니다.
   9. 파스퇴르 피펫을 사용하여 예열된 트립신-EDTA 4mL(각 튜브에 8개의 피질)가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 피질을 옮깁니다. 피질 조직을 37°C에서 5-7분 동안 트립신-EDTA에 노출시킵니다.
   10. 파스퇴르 피펫을 사용하여 트립신-EDTA를 조심스럽게 제거하고 원심분리기 튜브에 400μl의 0.15mg/mL DNAse I 용액을 추가합니다. 모든 조직이 해리되고 액체에 남아 있는 조직 조각이 없을 때까지 튜브 또는 와류를 교반합니다. 조직을 완전히 용해시킬 수 없는 경우 파스퇴르 피펫 끝으로 나머지 조각을 제거하십시오.
   11. 해리된 세포 용액이 들어 있는 튜브를 200 x g에서 3분 동안 원심분리하고 세포를 방해하지 않고 파스퇴르 피펫으로 상층액을 제거합니다. 마이크로피펫으로 1mL의 성상세포 배양 배지(단계 2.1.2에서 정의)를 튜브에 추가하고 교반하여 재현탁하고 균질한 용액을 생성합니다.
   12. 혈청학적 피펫을 사용하여 10mL의 성상세포 배양 배지를 T-75 플라스크로 옮깁니다. 마이크로피펫과 함께 1mL 세포 용액 250μl(2.1.11단계에서 준비)를 플라스크에 추가하여 플라스크당 1개의 강아지 뇌 분량을 플레이트에 넣습니다. 배출된 세포 용액을 배양 배지 전체에 고르게 분포시키고 플라스크를 부드럽게 교반하여 균일한 분포를 더욱 촉진합니다.
   13. 도금된 플라스크를 37°C 및 5% CO₂의 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 배양에서 24시간 및 72시간에 도달한 후 플라스크를 기계적으로 교반하여 뉴런 및 희소돌기아교세포와 같은 비부착성 세포 유형을 분리합니다.
   14. 그런 다음 이러한 각 시점에서 미디어 변경을 수행합니다. 플라스크를 수직으로 잡고 배양 배지가 부착된 세포를 덮지 않고 플라스크 바닥에 놓이도록 합니다. 파스퇴르 피펫으로 배양 배지를 흡인하고 세포가 추출되지 않도록 피펫 끝을 플라스크의 하단 모서리에 누릅니다. 플라스크를 원래의 수평 위치에 놓고 혈청학적 피펫으로 세포 위에 10mL의 성상교세포 배지를 부드럽게 추가합니다.
   15. 각 배지 교체 후 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 90% 농도가 달성된 후 플라스크를 한 번 더 기계적으로 교반하여 남아 있는 비부착 세포를 제거합니다.
   16. 진공 청소기와 파스퇴르 피펫으로 배양 배지를 꺼내 성상세포를 통과시킵니다. 부착된 세포 위에 혈청학적 피펫과 함께 0.25% 트립신-EDTA 5mL를 추가합니다. 트립신이 모든 세포를 덮도록 플라스크를 부드럽게 교반하고 37°C 및 5% CO₂에서 5-7분 동안 플라스크를 배양합니다.
   17. 혈청학적 피펫으로 1mL의 성상교세포 배지를 세포에 첨가하여 트립신을 소멸시킵니다. 혈청학적 피펫으로 플라스크에서 세포 용액을 추출하고 멸균 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 200 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
   18. 혈청학적 피펫으로 상층액을 제거하고 1mL의 성상세포 배양 배지에 재현탁합니다. 세포 용액이 균질한지 확인하기 위해 튜브를 교반합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기로 용액의 세포 수를 계산합니다.
       메모: 90% 융합된 플라스크는 일반적으로 약 300만 개의 성상세포를 생성합니다.
   19. 10mL의 성상세포 배양 배지를 T-75 플라스크에 추가합니다. 250 μl의 세포 용액을 마이크로피펫으로 옮겨 1:4 희석을 수행하여(단계 2.1.18) 배양 배지가 이미 들어 있는 T-75 플라스크에 넣습니다. 플라스크 표면 전체에 균일한 세포 분포를 보장하기 위해 부드럽게 교반합니다.
   20. 세포 통과를 위해 90% 포화도가 달성될 때마다 2.1.16-2.1.19 단계를 반복합니다.
2. 쥐 태아로부터 피질 뉴런 분리
   1. 예열 배지가 Neurobasal 배지 + 2% B-27 보충제(뉴런용) + 1% G-5 무혈청 보충제(성상세포용) + 0.25% L-글루타민으로 구성된 공동 배양 배지라는 점을 제외하고 2.1.1 및 2.1.2 단계와 유사한 제제를 따르십시오.
   2. 임신 18일째 Sprague-Dawley 쥐를 이산화탄소 질식으로 안락사시키고 참수형으로 사망을 확인한다.
   3. 쥐 태아를 추출하고 식힌 화강암 블록 표면에 HBSS가 포함된 페트리 접시에서 대뇌 조직의 나머지 부분과 피질을 해부하며, 시각적 안내를 위한 입체경과 살균된 가위, 미세 메스 및 겸자를 사용합니다. 머리, 뇌, 대뇌 반구 및 피질을 연속적으로 해부한 후 각 조직을 새로운 HBSS로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다.
   4. 트립신의 표면적을 늘리기 위해 피질 조직을 더 작은 조각으로 다집니다. 파스퇴르 피펫으로 4-6개의 피질을 5mL의 예열된 트립신-EDTA가 있는 튜브로 옮기고 조직을 분리하기 위해 37°C를 유지합니다. 5-7분에 튜브를 수동으로 교반하여 혼합하고 조직이 뭉치는 것을 방지합니다.
   5. 10분 후 37°C에서 튜브를 제거합니다. 앞서 2.1단계에서 설명한 바와 같이 트립신-EDTA를 추출하고 1.8mL의 0.15mg/mL DNAse 용액으로 대체합니다. 그 후, 용액이 액체에 떠다니는 조직 조각이 없이 균질하게 나타날 때까지 조직을 와류로 회전시킵니다.
   6. 해리된 조직 용액을 200 x g에서 3분 동안 원심분리합니다. 상등액을 제거한 후 2mL의 공동 배양 배지에 재현탁합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기로 이 용액의 세포 수를 세십시오.
      메모: 일반적인 수율은 3.0-5.0 x 10⁶ 세포/피질 반구입니다.
   7. 위에 정의된 공동 배양 배지에서 2.0-4.0 x 10⁵ cells/mL의 밀도를 가진 새로운 세포 용액을 준비합니다.

3. 마이크로 컬럼 내부의 Astrocytic 케이블 개발

1. ECM 코어 제작
   참고: ECM은 세포 파종(cell seeding)이 수행되는 당일에 하이드로겔 마이크로 컬럼 내부에 추가되어야 합니다.
   1. 생물 안전 캐비닛 내부에서 멸균 마이크로 원심분리기 튜브의 공동 배양 배지에 쥐꼬리 유형 I 콜라겐의 1mg/mL 용액을 준비합니다. ECM 용액이 포함된 마이크로 원심분리기 튜브를 사용할 때를 제외하고 항상 얼음 위에서 유지하십시오.
   2. 마이크로피펫을 사용하여 ECM 용액 1-2μL를 리트머스 종이 스트립에 옮겨 pH를 추정합니다. 1 μL의 1 N 수산화나트륨(NaOH) 또는 염산(HCl)을 마이크로피펫에 첨가하여 ECM 용액의 pH를 각각 높이거나 낮추고, 위아래로 피펫팅하여 균질화합니다. 리트머스 종이 스트립으로 새 pH를 확인하고 pH가 7.2-7.4 범위에서 안정될 때까지 필요에 따라 더 많은 산 또는 염기를 추가합니다.
   3. 1.2단계에서 페트리 접시를 해부 후드로 옮기고 4-5개의 마이크로 컬럼 또는 멸균된 미세 집게가 있는 보트를 비어 있는 멸균 35mm 또는 60mm 페트리 접시로 옮깁니다. 입체경을 사용하여 마이크로피펫의 10μL 팁을 각 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 놓고 흡입하여 DPBS와 기포의 내강을 비웁니다. 스테레오스코프로 기포가 없는지 확인하여 다음 단계에서 추가된 ECM이 내강을 가로질러 자유롭게 흐를 수 있는지 확인합니다.
   4. P10 마이크로피펫에 ECM 용액을 충전하고, 10μL 팁을 하이드로겔 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 대고, 내강을 채울 수 있는 충분한 용액(약 3-5μL)을 전달하여 입체경으로 ECM의 진입을 관찰합니다. 마이크로 컬럼의 양쪽 끝에 있는 ECM 용액의 작은 저장소(2-4μL)를 피펫으로 만듭니다.
      메모: 마이크로 컬럼 구조가 구겨질 수 있으므로 구조물의 장기간 건조를 방지하기 위해 항상 한 번에 4-5개의 마이크로 컬럼 또는 하나의 보트를 관리하십시오. 완전히 건조된 마이크로 컬럼이 페트리 접시 표면에 단단히 부착되어 세포 파종에 사용되는 것을 방지합니다. 과도한 양의 공동 배양 배지(수화 측정)는 아래에 설명된 배양 기간 동안 ECM이 유출될 수 있기 때문에 마이크로 컬럼에 추가할 수 없습니다.
   5. 페트리 접시 주위의 고리에 배지를 피펫으로 공동 배양하여 배양 중에 컬럼이 건조되는 것을 방지하기 위해 습도 싱크를 제공합니다. ECM 함유 마이크로 컬럼이 포함된 페트리 접시를 37°C 및 5% CO₂에서 1시간 동안 배양하여 뉴런 및/또는 성상세포를 추가하기 전에 콜라겐의 중합을 촉진합니다.
      메모: ECM은 내부를 둘러싸고 있는 단단한 ECM 코어가 아니라 속이 빈 루멘의 내부 표면을 코팅하는 층을 형성해야 하며, 둘 다 입체경을 사용하여 관찰할 수 있습니다. ECM이 코어를 형성하는 경우 층만 남을 때까지 배양 기간을 계속합니다. 이 층이 형성되면 성상교세포 세포 용액은 도금 단계에서 마이크로 컬럼의 내부를 채울 수 있습니다.
   6. 배양 기간 동안 성상세포 세포 용액을 준비합니다(아래 설명 참조).
2. micro-column에서의 astrocyte 및 neuroron seeding
   1. 2.1.16-2.1.19 단계에서 설명한 대로 도금된 성상세포(4번째와 12번째 통과 사이)를 통과시킵니다. 플라스크의 세포 수를 계수한 후 세포 배양 배지에 현탁된 9.0-12.0 x 10⁵ cells/mL 용액의 밀도에서 세포 용액을 준비합니다.
   2. 입체경을 사용하여 P10 마이크로피펫의 끝을 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 놓고 충분한 세포 용액(~5μL)을 내강으로 옮겨 완전히 채웁니다. ECM을 사용하여 위에서 수행한 것처럼 각 마이크로 컬럼의 양쪽 끝에 작은 세포 용액 저장소를 추가합니다.
   3. 페트리 접시에 도금된 마이크로 컬럼을 37°C 및 5% CO₂에서 1시간 동안 배양하여 ECM에 성상세포의 부착을 촉진합니다. 뉴런이 마이크로 열에 추가되지 않으면 3.2.5단계로 진행합니다.
   4. 초기 배양 기간이 끝나면 2.2.7 단계에서 얻은 1-2 μL의 피질 뉴런 용액을 마이크로 피펫으로 마이크로 컬럼의 양쪽 끝에 첨가하고 입체경 아래에서 관찰합니다. 건조를 피하기 위해 접시에 충분한 매체가 있는지 확인하고 뉴런이 접착될 수 있도록 37°C 및 5% CO₂에서 40분 동안 다시 배양합니다.
      메모: 피질 뉴런 용액은 또한 번들 형성 후 1-2일 후에 첨가할 수 있으며, 마이크로피펫으로 페트리 접시에서 배양 배지를 조심스럽게 제거한 후 3.2.4단계를 수행합니다.
   5. 배양 기간이 끝나면 도금된 마이크로 컬럼이 포함된 페트리 접시에 각각 35mm 또는 60mm 페트리 접시에 대한 3 또는 6mL의 공동 배양 배지를 조심스럽게 채웁니다. 6-10시간 후에 묶인 케이블과 같은 구조를 형성해야 하는 정렬된 성상세포 다발의 자체 조립을 촉진하기 위해 37°C 및 5% CO₂에서 배양에서 도금된 마이크로 컬럼을 유지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
침 (직경 300 μm)	라싸 메디컬	하이.30x40	직경은 마이크로 컬럼 루멘에 대해 원하는 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
페트리 접시	어부	08772B
둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)	인비트로젠	14200075
폴리스티렌 일회용 혈청학 피펫	어부	13-678-11일
아가로스	시그마	A9539-50G
마이크로리터 유리 모세관 (701 μm)	어부	21-170J	직경은 마이크로 컬럼 쉘에 대해 원하는 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
마이크로캡 전구 디스펜서	어부	21-170J	전구는 마이크로캡 튜브와 함께 제공됩니다.
핫 플레이트	어부	SP88857200
마그네틱 바	어부	1451352
마이크로피펫	시그마	Z683884-1개
25mm 게이지 바늘	어부	Tel.: 14-826-49
마이크로 메스	로보즈 서지컬	RS-6270
가위	정밀 과학 도구	14081-09
집게	세계적인 정밀 기기	501985
핫 비드 살균기	시그마	Z378550-1개
입체경	니콘	SMZ800N
마이크로 주걱	어부	S50821
쥐 꼬리 I 형 콜라겐	코 닝	354236	4ºC에서 유지하고 필요할 때만 제거하십시오. 사용 중 온도를 유지하기 위해 얼음을 사용하십시오.
마이크로 원심분리기 튜브	어부	02-681-256
수산화나트륨(NaOH)	어부	SS2661
염산(HCl)	어부	SA48-1
리트머스 종이	어부	09-876-18
행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)	인비트로젠	14170112	4ºC에서 보관하십시오.
0.25% 트립신-EDTA	인비트로젠	25200056	-20ºC에서 보관하고 사용하기 전에 37ºC에서 데우십시오.
소 췌장 데옥시리보뉴클레아제(Dnase) I	시그마	10104159001	-20ºC에서 보관하고 사용하기 전에 37ºC에서 데우십시오.
Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)과 Ham의 F-12 영양소 혼합물	지브코	제11330-032	4ºC에서 보관하십시오.
소 태아 혈청(FBS)	애틀랜타 바이오로직스	S11195	-20ºC에서 보관하십시오.
출생 후 0일차 또는 1일차 Sprague Dawley 새끼	찰스 리버	스트레인 001
Neurobasal embryonic neuron 기저 배지	인비트로젠	21103049	사용하기 전에 4ºC에서 보관하고 37ºC에서 따뜻하게 하십시오.
B-27 무혈청 보충제	인비트로젠	12587010	-20ºC에서 보관하고 사용하기 전에 37ºC에서 데우십시오.
L-글루타민	인비트로젠	35050061	-20ºC에서 보관하고 사용하기 전에 37ºC에서 데우십시오.
G5 성상세포 보충제	인비트로젠	17503012
Sprague Dawley 배아 일 18 쥐	찰스 리버	스트레인 001
파스퇴르 피펫	어부	제22-042816
15 mL 원심분리기 튜브	유럽, 중동, 아프리카	제1194-352099
소용돌이	어부	02-215-414
원심 분리기	어부	TEL:05-413-115
혈구계	어부	02-671-6
부 화기	어부	13 998 076