편광 신경 조직의 엔지니어링된 실크-콜라겐 기반 3D 모델 개발

Abstract

출처: Chwalek, K. et al., 편광 신경 조직의 엔지니어링 3D 실크 콜라겐 기반 모델.J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 실크 콜라겐 골격을 사용하여 3D 편광 신경 조직 모델을 만드는 방법을 보여줍니다. 다공성 실크 골격에 신경 세포를 파종하고, 세포 부착을 위해 배양하고, 골격에 콜라겐을 삽입하는 과정을 자세히 설명하고, 3D 편광 신경 조직 모델을 형성하는 데 있어 지지 콜라겐 매트릭스의 중요성을 강조합니다.

Protocol

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 실크 비계 준비

1. Bombyx mori 누에고치에서 실크 용액의 준비
   1. 가위를 사용하여 각 고치를 8등분으로 자릅니다. 조각난 고치 5g에 고치 11개 정도를 사용합니다. (15분)
   2. 0.02 M Na₂CO₃ 용액 2 L를 준비하고 핫 플레이트를 사용하여 끓입니다. (15분)
   3. 조각난 고치 5g의 무게를 달아 Na₂CO₃ 용액에서 30 분 동안 끓입니다. 끓는 실크를 주걱으로 2 분마다 저어줍니다. 탈검밍(de-gumming)이라고 하는 이 단계는 친수성 단백질인 세리신(sericin)에서 실크 피브로인을 정제합니다. (30분)
   4. 손으로 피브로인을 짜내고 증류수로 최소 3회 헹구어 남아 있는 세리신과 화학 물질을 씻어냅니다. (5분)
   5. 젖은 피브로인을 페트리 접시에 놓고 플로 후드 O/N에서 피브로인 추출물을 건조시킵니다.
   6. 다음날, 건조 피브로인 덩어리의 무게를 측정하고 피브로인을 유리 비커에 넣습니다. (15분)
   7. 9.3M LiBr 용액에 피브로인을 용해시키려면 건조 피브로인 질량에 4를 곱하여 필요한 LiBr 부피(ml)를 계산합니다. 실크 피브로인 위에 LiBr 용액을 천천히 붓고 주걱을 사용하여 모든 피브로인 섬유를 담그십시오. 증발을 방지하기 위해 비커를 덮고 섬유가 용해될 수 있도록 60°C에서 4시간 동안 놓습니다. (15분)
   8. 주사기를 사용하여 비커에서 피브로인 용액을 채취하여 MWCO 3,500 투석 카세트에 로드합니다. 증류수에 대해 48시간 동안 투석을 수행합니다. 두 시간마다 물을 갈아주세요.
   9. 주사기를 사용하여 카세트에서 피브로인 용액을 50ml 원뿔형 튜브로 모으고 9,000rpm(~12,700 x g)에서 4°C에서 20분 동안 두 번 원심분리합니다. 각 원심분리 단계 후에 상등액을 새 튜브에 붓고 펠릿을 버립니다. (40분)
   10. 건조 중량을 추정하여 피브로인의 농도를 측정합니다. 실크 용액 1ml를 계량 보트에 붓습니다. 샘플을 60°C의 오븐에서 2시간 동안 건조시킵니다. 건조 실크 피브로인의 무게를 측정하고 얻은 무게에 100을 곱하여 실크 피브로인 용액의 농도를 계산합니다. 실크 용액의 예상 농도는 6-9%(w/v)입니다.
   11. 실크 농도를 증류수에 희석하여 6%(w/v)로 조정합니다.
       정지 지점: 액체 실크 피브로인은 밀폐된 용기에 최대 1개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 실크 용액으로부터 다공성 골격의 준비.
   1. 과립 NaCl을 체질하여 500-600 μm 과립을 분리하며, 이는 이후 단계에서 사용됩니다. 500μm 미만 및 600μm 이상의 과립을 폐기합니다(15분).
   2. 30ml의 6% 실크 용액을 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 몰드에 붓습니다(그림 1). 체로 쳐진 NaCl 60g을 실크 위에 부드럽게 뿌립니다. 용기를 두드려 균일한 소금 층을 얻습니다. 실크를 중합하기 위해 RT에서 48 시간 배양하십시오.
   3. 골격이 포함된 PTFE 몰드를 60°C의 오븐에 1시간 동안 놓고 중합을 완료하고 남아 있는 액체를 증발시킵니다.
   4. PTFE 몰드의 내용물을 증류수 2L가 담긴 비이커에 48시간 동안 넣어 소금을 침출합니다. 하루에 2-3 번 물을 바꾸십시오. 소금이 완전히 침출되면 틀에서 스폰지 지지대를 제거합니다.
      정지 지점: 스폰지는 골격의 탈수를 방지하기 위해 밀폐된 용기에 4°C의 물에 담근 상태로 보관할 수 있습니다.
   5. 준비가 되면 5mm 직경의 생검 펀치로 골격을 잘라냅니다. 높이가 약 2mm가 되도록 비계를 미리 자릅니다. 직경 2mm의 생검 펀치로 골격의 중앙을 펀칭합니다(그림 2A). (1시간)
   물에
   6. 담근 골격을 오토클레이브하여 살균합니다(습식 주기, 121°C, 20분).
      정지 지점: 스폰지는 골격의 탈수를 방지하기 위해 밀폐된 용기에 4°C의 물에 담근 상태로 보관할 수 있습니다.
   7. 계획된 세포 파종(cell seeding) 전에 골격을 멸균 0.1mg/ml 폴리-D-라이신(PDL) 용액에 담그십시오. 37 °C에서 1 시간 동안 배양합니다.
   8. 인산염 완충 식염수(PBS)로 골격을 3x 세척하여 결합되지 않은 PDL을 제거합니다. (30분)

2. 쥐 피질 뉴런의 분리

1. 승인된 동물 프로토콜을 얻은 후 배아 18일(E18) Sprague-Dawley 쥐의 피질을 해부합니다. (2시간)
2. 0.25% 트립신 5ml에 0.3% DNase I(소 췌장에서 추출)과 함께 10개의 피질을 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
3. 대두 단백질 1mg/ml를 첨가하여 트립신을 비활성화합니다.
4. 10ml 파스퇴르 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액이 생성될 때까지 위아래로 20회 피펫팅하여 피질을 분쇄합니다. 부드럽게 하고 기포 형성을 피하십시오. (10분)
5. 127 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
6. 세포 펠릿을 10ml의 배양 배지(Neurobasal 배지, 1x B27 보충제, 1x 글루타맥스, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 재현탁합니다. 세포를 세십시오. 예상 세포 농도는 약 2x10⁷/ml입니다. (20분)

3. 어셈블리와 문화 구성

1. 세포를 사용한 스캐폴드 파종
   1. 멸균 골격과 필요한 모든 기구를 세포 배양 후드 내부로 이동합니다. 멸균 집게를 사용하여 96웰 세포 배양 플레이트에 스캐폴드를 배치하고 웰당 하나의 스캐폴드를 할당합니다. (10분)
   2. 세포 배양 배지에 골격을 담궈 세포 파종 전에 평형을 이룹니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 배양합니다. (10 분)
   3. 골격에서 매체의 초과분을 흡인합니다.
   4. 100μl의 세포 현탁액/골격을 적용합니다. (10분)
   5. 세포가 골격에 부착될 수 있도록 37°C O/N에서 세포를 배양합니다.
   6. 다음 날 아침, 부착되지 않은 세포를 흡인하고 200μl/well의 신선한 배양 배지를 적용합니다. (10분)
2. 콜라겐 매트릭스가 포함된 스캐폴드 임베딩. (2시간)
   1. 얼음 위에 PBS 10개, 물, N NaOH 1개, 쥐 꼬리 I 콜라겐을 놓습니다. 제조업체의 지침에 따라 콜라겐의 작업 용액을 준비하십시오. cell-seeded 구조체가 준비될 때까지(최대 1시간) 얼음 위에서 유지합니다.
   2. 인큐베이터에서 세포 파종 실크 구조체를 제거하고 과도한 배지를 흡인합니다.
   3. 멸균 집게를 사용하여 골격을 웰 플레이트의 빈 웰로 옮기고 각 골격을 100μl의 3mg/ml 콜라겐 용액에 담그십시오. 조직 배양 플레이트를 다시 인큐베이터에 30분 동안 넣어 콜라겐 중합을 허용합니다.
   4. 예열된 세포 배양 배지/웰 100μl를 도포합니다. 일주일 동안 구조물을 배양하고 매체 부피의 절반만 교체하여 매일 매체를 변경합니다.

Results

그림 1. 실크 스폰지 비계 준비에 사용되는 PTFE 금형. 크기 : 직경 10cm, 높이 2cm.

그림 2. 3D 뇌와 유사한 조직 모델. (A) 다공성 실크 스폰지 스폰지 비계. (B) 콜라겐 매립 전 실크 골격에 파종할 때 1일차에 뉴런의 살아있는/죽은 염색(녹색-살아있는 세포, 적색-죽은 세포). 오른쪽의 패널은 빨간색 프레임으로 캡처된 영역의 배율을 보여줍니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
원심분리기 5804 R	에펜도르프
폴리 -D- 라이신	시그마-알드리치	P6407-5MG	최종 농도 10 μg/ml, 물에 용해
Neurobasal 배지	지브코	21103049	사용하기 전에 37°C까지 예열
B27 보충제 50x	지브코	제17504-044
글루타맥스	지브코	제35050-061
페니실린 스트렙토마이신	코 닝	30-002-CI
콜라겐 I, 쥐 꼬리, 100mg	코 닝	354236	최종 농도 : 3 mg / ml
나오	시그마-알드리치	S2770	부식성의
PBS (PBS)	시그마-알드리치	D1283-500ML
나2CO3	시그마-알드리치	제223530
리브르	시그마-알드리치	213225
MWCO 3500 투석 카세트	써모 피셔	66110
가열판	피셔 사이언티픽	아이소템프
체	피셔 사이언티픽	270 호, 35 호, 30 호
폴리에틸렌			집에서 만든 곰팡이 (그림 1) 지름 10cm, 높이 2cm
염화나트륨	시그마-알드리치	71382
바이옵시 펀치 5mm	세계 정밀 기기	501909
바이옵시 펀치 2mm	세계 정밀 기기	501908
트립신	시그마-알드리치	T4049-500ML
DNase	로슈	10104159001	최종 농도 0.3%
대두 단백질	시그마-알드리치	T6522-100MG	최종 농도 : 1 mg / ml