인간 만능 줄기 세포에서 유래 한 분화 된 뉴런 리플레팅

초록

출처: Calabrese, B. et al., 신경 형성 및 시냅스 성숙의 High-content Screening을 위한 인간 만능 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 도금. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 가벼운 단백질 분해 효소를 사용하여 인간 만능 줄기 세포 유래 뉴런을 분리하고 재식하는 방법을 보여줍니다. 여과 및 원심분리 후, 뉴런은 배양을 위해 코팅된 멀티웰 플레이트에 재도금되어 부착 및 성숙을 촉진합니다.

프로토콜

1. 리플레이팅 전 차별화 기간

1. 뉴런이 돌기와 함께 두꺼운 네트워크를 형성하고 MAP2 또는 TuJ1과 같은 초기 뉴런 마커뿐만 아니라 NeuN과 같은 후기 마커도 발현할 때까지 선택한 프로토콜을 사용하여 10cm 접시의 뉴런을 구별합니다.
2. 신경 분화 과정 동안 4일마다 선택한 배지의 절반을 변경합니다.
   메모: 더 광범위하거나 빈번한 매체 변화는 필수 영양 인자를 희석시키고 성숙을 선호하지 않을 수 있습니다.
   1. iPSC 유래 WT126 뉴런의 경우, 500mL Dulbecco의 변형 Eagle's medium/nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)에 대해 5 mL 100x N2 (신경) 보충제, 10 ng/mL 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 10 ng/mL 신경교세포주 유래 신경 영양 인자(GDNF), 1 μg/mL 라미닌, 200 μM 아스코르브산, 1 μM 디부티릴-cAMP 및 10 mL SM1을 사용합니다. 점차적으로 하프 배지 변경을 사용하여 신경 기저 매체(Table of Materials)와 동일한 보충제로 교체합니다.
   2. 유도 만능 줄기세포 또는 iPSC 유래 CVB WT 뉴런의 경우, 500mL 신경 기저 A 배지(Table of Materials) 및 2μg/mL laminin, 10mL 글루타민 보충제(Table of Materials), 0.75mg/mL sodium bicarbonate, 5mL minimum essential medium(MEM) 비필수 아미노산 5mL, 0.2mM 아스코르브산, 10ng/mL BDNF, 20mL 50x B27 및 10mL 100x N2 보충제.

2. 코팅 멀티웰

1. 리플레이팅 전날에는 폴리-L-오르니틴(PLO)으로 코팅합니다. PLO를 멸균수에 용해시켜 원액(10mg/mL)을 만듭니다. 이 재고를 -20 °C에서 보관하십시오.PLO를 물에 1:100으로 희석하면 유리 코팅 시 50μg/mL, 플라스틱 코팅 시 1:1,000 비율(10μg/mL)의 농도가 생성됩니다.
2. 코팅을 대상 플레이트에 직접 적용하십시오. 플레이트 크기에 적합한 코팅량을 사용합니다(즉, 24웰 플레이트의 경우 웰당 500μL의 PLO 용액 적용).
3. 접시를 실온에서 밤새 어두운 곳에 두십시오.
4. 재도금 당일에 코팅된 플레이트를 회수하여 멸균 생물 안전 작업대로 옮깁니다.
5. PLO 용액을 흡입하고 멸균수로 두 번 헹굽니다.
6. 인산염 완충 식염수(PBS)에 라미닌(1.15mg/mL)을 1:400 희석으로 희석합니다.
   메모: 라미닌을 4°C에서 해동하고 PBS에 빠르게 첨가하여 라미닌의 응집과 불균일한 코팅을 방지합니다.
7. 멸균수를 흡입하고 이전에 PLO로 코팅된 웰에 500μL의 라미닌 코팅을 적용합니다.
8. 플레이트를 37 ° C 인큐베이터에 최소 4-6 시간 동안 놓습니다. 유리 표면의 경우 최대 16 시간까지 더 긴 인큐베이션을 사용하십시오. 일관된 배양 시간을 사용합니다.

3. 분화된 뉴런 리플레이션

1. PBS로 분화된 뉴런의 플레이트를 한 번 부드럽게 헹굽니다. PBS를 세포에 직접 전달하지 말고 플레이트 벽을 따라 부드럽게 분산시켜 세포가 파괴되지 않도록 합니다.
2. PBS를 부드럽게 흡인하되, 세포를 직접 만지지 않도록 주의하되 접시 가장자리에서 흡인하면서 연구자 쪽으로 기울이십시오.
3. 10cm 플레이트당 최소 1mL의 단백질 분해 효소(Table of Materials)를 도포하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 조직 배양실이 낮은 습도로 인해 높은 증발 속도를 보이는 경우 약간 더 높은 부피를 추가합니다.
4. 단백질 분해 효소로 세포를 40-45분 동안 배양하여 플레이트에서 세포를 분리하고 뉴런 네트워크 내의 다른 뉴런에서 분리합니다.
   메모: 이 단계에서는 타이밍이 중요합니다. 프로테아제를 너무 일찍 담금질하면 재생 후 세포 사멸이 증가할 수 있습니다. 단백질 분해 효소 제조업체는 세포주를 계역으로 전달하기 위해 37°C보다 훨씬 낮은 온도를 사용하여 배양 기간을 연장할 것을 권장합니다(예: 4°C에서 하룻밤). 그러나 4°C에서 뉴런을 다루는 것은 추위에 노출된 후 생존율이 떨어지는 경우가 많으므로 피해야 합니다. 제조업체는 또한 37°C에서 효소로 60분 동안 배양하면 효소 불활성화가 발생한다고 말합니다. 그러나 저자의 경험에 따르면 37°C에서 hiPSC 유래 신경 세포 배양을 40-45분 동안 배양하는 것은 효율적인 해리와 재도금 시 우수한 신경 세포 생존에 충분합니다.
5. 배양 시간 동안 위상차 현미경에서 뉴런을 확인하고 신경망이 플레이트에서 완전히 분리되고 현미경 아래에서 플레이트를 잠시 흔들면 더 작은 시트로 분해되기 시작할 때까지 프로테아제 처리를 계속합니다.
6. 분해를 중단하기 위해 10cm 플레이트에 프로테아제 1mL당 5mL의 새로운 DMEM 배지를 사용하여 프로테아제 활성을 소멸시킵니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 플레이트에 대고 5-8회 부드럽게 분쇄하여 네트워크를 방해합니다. 분화된 뉴런은 약하므로 트리투싱(trituring)할 때 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의해야 합니다. P1000 팁은 끝이 너무 날카롭고 좁아서 뉴런이 깎이거나 손상될 수 있으므로 사용하지 마십시오.
7. 직경 100μm의 메쉬 모양의 세포 여과기를 통해 세포가 포함된 용액을 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 한 방울씩 떨어뜨립니다.
8. 세포가 여과된 후 새 DMEM 배지 5mL로 스트레이너를 추가로 헹굽니다.
9. 벤치탑 원심분리기에서 1,000 x g에서 5분 동안 세포를 회전시킵니다.
10. 원뿔형 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 되돌리고 대부분의 배지를 흡입하여 세포가 수분을 유지할 수 있도록 약 250μL를 남겨둡니다.
11. 2mL의 새로운 DMEM 배지에 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 펠릿을 튜브 측면에 피펫으로 연결하지 마십시오. 대신, 원뿔형 튜브를 2-3회 부드럽게 뒤집고 5mL 혈청학적 피펫 끝에 세포를 통과시켜 세포를 제거합니다.
12. 10μL의 부유 뉴런을 혈구계의 가장자리에 적용합니다.
13. 이 재현탁 단계에서 세포 생존율을 평가하기 위해 세포 방울에 8-10μL의 트리판 블루를 추가합니다. 이 혼합물 10 μL를 혈구계 또는 기타 자동 세포 계수기에 적용합니다. 위상이 밝고 트리판 블루 염료를 제외하는 세포를 생존 가능한 것으로 평가합니다.
14. 생존 가능한 세포/mL의 양을 결정하고 원하는 세포 밀도에 따라 원뿔형 튜브의 내용물을 희석할 준비를 합니다.
15. 384웰 플레이트의 경우 웰당 ~10,000개의 세포를 플레이트화합니다. 24웰 플레이트의 경우 웰당 ~150,000-200,000개의 셀을 플레이트합니다.
16. 적절한 희석을 달성하기 위해 재현 유탁 세포의 원뿔형 튜브에 새로운 DMEM을 첨가하고 특정 세포주의 요구 사항에 따라 B27 및/또는 BDNF와 같은 적절한 보충제를 추가로 첨가합니다.
17. 원뿔형 튜브를 부드럽게 기울여 2-3회 혼합합니다.
18. 16채널 피펫을 사용하여 24웰 플레이트 또는 384웰 멀티웰 플레이트에서 라미닌 코팅을 흡입하고 PBS로 한 번 헹굽니다.
19. 24웰 플레이트의 경우 P1000을 사용하거나 384웰 플레이트의 경우 16채널 피펫을 사용하여 PBS를 흡입합니다.
20. 뭉침을 방지하기 위해 각 웰에 세포 용액을 8자 동작으로 적용합니다. 도금 균일성은 자동화된 액체 취급 장치를 사용하여 최적화할 수도 있습니다.
    메모: 리플래팅 후 2-4일 후부터 배지에 라미닌을 첨가하는 것도 세포의 균일한 분포를 유지하는 데 도움이 됩니다.
21. 각 웰에 대해 3.19 및 3.20단계를 반복합니다.
22. 플레이트를 37°C와 5% 이산화탄소로 설정하고 인큐베이터에 다시 넣습니다.
23. 2일 후, 섹션 1.2에 설명된 분화 후 배양 배지를 사용하여 4일마다 배지의 절반을 변경하기 시작합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
L-아스코르브산	시그마	A4403	1L의 N2B27 미디어에 200mM 스톡 1ml를 추가합니다
디 부티 릴 -cAMP	시그마	D0627	1μM 추가
인간 BDNF	페프로텍	450-02	10ng/ml 최종 농도
B27 (50배)	써모피셔 사이언티픽	17504044	1L N2B27 미디어에 20ml 추가
DMEM/F12와 글루타맥스	써모피셔 사이언티픽	31331093	N2를 첨가하고 50mL 원뿔형으로 분배합니다. 파라필름 랩 뚜껑
인간 GDNF	페프로텍	450-10	10ng/ml 최종 농도
글루타맥스	써모피셔 사이언티픽	35050038	1L N2B27 매체에 10ml를 추가하십시오; 글루타민 보충
마우스 라미닌	시그마	P3655-10mg	50mL N2B27에 100μl 첨가
MEM 비필수 아미노산	써모피셔 사이언티픽	11140035	1L N2B27 미디어에 5ml 추가
N2 (100X) 보충제	생명 기술	17502048	500mL 미디어에 5ml 추가
Neurobasal A 미디어	써모피셔 사이언티픽	10888022	DMEM/F12와 결합하여 CVB wt 세포용 N2B27 배지 생성; 신경 기저 A 배지
Neurobasal 배지	써모피셔 사이언티픽	21103049	WT126 세포용, 신경 기초 배지
SM1 보충제	스템셀 기술	5711	미디어에 1:50 추가
중탄산나트륨	써모피셔 사이언티픽	제25080-094	1L N2B27 미디어에 10ml 추가
플레이트 준비
10cm 조직 배양 접시	피셔 사이언티픽	08772-E	플라스틱 TC 처리 접시
6-well 조직 배양 접시	토마스 사이언티픽	1194Y80	NEST 플레이트
마우스 라미닌	생명 기술	23017-015	플라스틱에 1:400 추가
폴리오르니틴	v	P3655-10mg	플라스틱에 1:1000 추가
UltraPure 증류수	생명 기술	제10977-015	Poly-L-Ornithine을 희석하기 위하여
리플레팅 시약
100mM 세포 여과기	코 닝	431752	멸균, 개별 포장
384웰 플레이트, 코팅되지 않음	퍼킨엘머	6007550	PLO와 Laminin으로 코팅
디피에스	생명 기술	14190144	Dulbecco의 인산염 완충 식염수
Poly-D-Lysine-Precoated 384웰 플레이트	퍼킨엘머	6057500	라미닌으로 코팅하기 전에 헹굽니다.