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1. 포토리소그래피에 의한 SU-8 금형 제작
참고: 이 절차에는 유해 화학 물질이 포함됩니다. 전체에 흄 후드와 PPE를 사용하십시오.
- 실리콘 웨이퍼(직경 4인치, 두께 1mm, 광택 처리)를 아세톤으로 세척하고 질소 가스로 불어냅니다. 그런 다음 180 ° C에서 3 분 동안 건조시켜 굽습니다.
- 세척된 웨이퍼에 SU-8 2100 3mL를 분배합니다.
- 스핀 코터를 500rpm으로 10초 동안 웨이퍼에 SU-8을 균일하게 코팅한 다음 300rpm/s의 가속도로 30초 동안 1500rpm으로 순차적으로 회전하여 150μm 두께의 SU-8.
층을 얻습니다.
알림: 실리콘 웨이퍼가 스핀 코팅기의 중앙에 위치하고 진공으로 올바르게 고정되었는지 확인하십시오.
- 핫 플레이트의 웨이퍼를 50°C에서 10분, 65°C에서 7분, 95°C에서 45분 동안 소프트 베이크합니다.
- 포토마스크(그림 1)를 마스크 얼라이너에 놓고 자외선(365nm)을 60초 동안 노출시킵니다.
알림: 노출 시간은 적절한 양의 자외선으로 최적화해야 합니다.
- 노출 후 웨이퍼를 65°C에서 6분 동안 굽고 95°C에서 핫 플레이트에서 13분 동안 굽습니다.
- 궤도 쉐이커를 사용하여 교반하면서 SU-8 현상액에서 10-20분 동안 웨이퍼를 현상하고 공정 중에 현상 솔루션을 한 번 변경합니다.
참고: SU-8의 잔해가 남아 있을 때 현상 시간을 연장합니다.
- 웨이퍼를 이소프로판올로 헹구고 질소 가스로 웨이퍼를 부드럽게 건조시킵니다.
- 측정 현미경으로 증착된 SU-8의 높이를 측정하고 두께가 약 150μm인지 확인합니다. 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다.
2. 폴리디메틸실록산(PDMS) 미세유체 기반 조직 배양 칩 제조
- SU-8이 증착된 웨이퍼를 양면 테이프로 용기(예: 15cm 플라스틱 페트리 접시)에 고정합니다.
- 질소 가스를 사용하여 웨이퍼의 먼지를 불어냅니다.
- 실란화하려면 SU-8 증착 웨이퍼를 작은 용기(예: 35mm 접시)와 함께 진공 챔버에 넣습니다. 10μL의 (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane을 작은 용기에 떨어뜨립니다. SU-8 웨이퍼에 (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane을 직접 적용하지 마십시오.
- 진공 챔버를 단단히 닫고 진공 펌프를 최소 2시간 동안 켭니다.
- 플라스틱 컵을 가지고 실리콘 엘라스토머(예: Silpot 184 또는 이에 상응하는 Sylgard 184)와 경화제를 10:1 중량비로 붓습니다. 그런 다음 주걱을 사용하여 잘 섞고 거품이 완전히 제거될 때까지 진공 챔버에서 가스를 제거합니다.
- PDMS 혼합물을 SU-8 웨이퍼와 함께 용기에 원하는 두께(3-4mm)로 붓고 다시 가스를 제거하여 기포를 제거합니다.
- PDMS를 60°C의 오븐에서 최소 3시간 동안 굽면 PDMS가 완전히 경화됩니다.
- 냉각 후 메스나 면도날을 사용하여 웨이퍼에서 경화된 PDMS를 절단합니다.
- 조직 배양 칩의 두 챔버를 만들려면 1.5mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 두 개의 구획이 있는 위치에 두 개의 구멍을 뚫습니다.
- 중간 저장소를 만들려면 다른 PDMS 혼합물(실리콘 엘라스토머와 경화제를 10:1 중량비로 준비)을 준비하고 새 10cm 페트리 접시에 붓습니다. 주입량을 PDMS 두께의 5mm로 조정합니다.
- PDMS를 60°C의 오븐에서 최소 3시간 동안 굽면 PDMS가 완전히 경화됩니다.
- PDMS를 냉각시킨 후 경화된 PDMS를 메스로 잘라 직사각형 고리를 만듭니다.
- 경화되지 않은 PDMS를 그 사이에 적용하고 조립된 PDMS 층을 베이킹하여 바닥 층을 매체 저장소와 접착합니다. 이 결합 구조는 PDMS 조직 배양 칩을 생성합니다.
- PDMS 조직 배양 칩을 스카치 테이프로 청소하여 표면에서 먼지와 작은 입자를 제거합니다. PDMS 조직 배양 칩은 먼지와 UV로부터 보호되는 경우 실온에서 보관할 수 있습니다.
3. 문화의 준비
- 문화매체
메모: 아래 나열된 모든 매체는 달리 명시되지 않는 한 멸균을 위해 여과되어야 합니다. 준비된 배지는 4°C에서 보관하고 한 달 이내에 사용할 수 있습니다.
- mTeSR Plus 배지를 준비하려면: 100mL mTeSR Plus 5x 보충제 1병과 400mL mTeSR Plus 기초 배지 1병을 결합합니다.
- KSR 배지 100mL 준비: Dulbecco의 Modified Eagle 배지 또는 DMEM/F12 85mL에 Knockout 혈청 대체제(KSR, 15%) 15mL, 상업용 글루타민 보충제 1mL(1%) 및 비필수 아미노산(NEAA, 1%) 1mL를 추가합니다.
- N2 배지 100mL를 준비하려면: Neurobasal 배지 100mL에 N2(100x) 1mL, 상업용 글루타민 보충제 1mL 및 NEAA 1mL를 추가합니다.
- 250mL의 성숙 배지를 준비하려면: 250mL의 Neurobasal 배지에 B27 5mL(2%), 상업용 글루타민 보충제 2.5mL(1%), 페니실린/스트렙토마이신 2.5mL(1%)를 추가합니다.
- 세포 배양 등급 DMSO의 화합물(레티노산(RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632)을 원하는 농도로 재현탁합니다. 부분 표본을 준비하고 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632와 같은 원액이 사용됩니다.
- 코팅
메모: 열에 의한 기저막 매트릭스의 중합을 방지하려면 반복적인 동결-해동 주기를 피하십시오. 가능한 경우 사전 냉각된 피펫 팁과 튜브로 모든 코팅 절차를 처리하십시오. 기저 멤브레인 매트릭스는 4°C에서 밤새 해동하고 미리 냉각된 피펫 팁과 튜브를 사용하여 분주해야 합니다. 부분 표본은 -20 °C 또는 -80 °C에서 동결할 수 있습니다.
- 얼린 부분 표본을 얼음 위에서 4°C로 해동합니다. 부분 표본은 코팅 절차 중에 차갑게 유지해야 합니다. 사전 냉각된 피펫 팁을 사용하여 기저 멤브레인 매트릭스를 얼음처럼 차가운 DMEM/F12로 1:40의 비율로 희석합니다. 사용하지 않은 희석된 기저막 매트릭스는 중합이 발생하지 않았다는 전제 하에 4°C에서 2-3일 동안 보관할 수 있습니다.
- 기저 멤브레인 매트릭스/DMEM-F12 용액 1mL를 추가하여 6웰 플레이트의 한 웰을 코팅합니다.
- 플레이트를 실온에서 최소 한 시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 코팅된 플레이트는 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
4. iPS 셀의 유지 관리
- 3.2단계에서 앞서 언급한 대로 기저막 매트릭스 코팅 접시를 준비합니다.
- mTeSR Plus 매체를 완전히 흡입합니다. PBS로 웰을 한 번 세척하고 0.5mL의 패시에이징 시약을 추가합니다(재료 표 참조). 몇 초간 기다렸다가 용액을 흡인합니다.
- 인큐베이터에서 37 °C의 플레이트를 5 분 동안 또는 세포가 둥글게 될 때까지 배양합니다 .
메모: 배양 시간은 iPS 세포주와 포화도에 따라 다를 수 있습니다. 배양 중 해리 시간을 결정하기 위해 현미경 아래를 주기적으로 확인하십시오.
- mTeSR Plus 배지 1mL를 넣고 플레이트를 30-60초 동안 두드려 콜로니를 분리합니다.
- 세포 현탁액 1mL와 새 mTeSR plus 배지 7mL를 부드럽게 혼합합니다. 5회 이상 피펫팅하지 마십시오.
- 1:8의 비율로 플레이트. 일반적으로 5.5단계에서 1mL의 현탁액을 추가하고 1mL의 mTeSR과 5-10μM의 Y-27632(ROCK 억제제)가 보충된 배지를 추가합니다. 계대 희석 비율은 iPSC 라인에 따라 다릅니다.
- 셀을 5% CO2/37°C 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날, 새로운 mTeSR Plus 배지를 추가하여 Y-27632를 제거합니다. 그 후, 처음에는 격일로, 세포가 더 높은 밀도에 도달하면 매일 배지를 교체하십시오.
5. iPS 세포를 운동 뉴런으로 분화
- 운동 뉴런 분화를 위한 파시징 iPSC
메모: 차별화는 3D(5.2) 프로토콜에서 성공적으로 수행될 수 있습니다.
- 미분화된 iPS 세포가 6-well 플레이트의 mTeSR Plus 배지에서 약 80%의 포화도에 도달할 때까지 성장할 수 있습니다.
- 매체를 완전히 흡인합니다. 즉시 멸균 PBS로 웰을 한 번 세척하고 세포에 0.5mL의 세포 해리 용액을 첨가합니다.
- 인큐베이터에서 37°C의 플레이트를 약 2-3분 동안 또는 세포가 분리되고 둥글어졌지만 웰에 부착된 상태로 유지될 때까지 플레이트를 배양합니다.
- 중간 크기 1mL를 추가하고 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 몇 번 부드럽게 피펫을 만듭니다. 세포 현탁액을 4mL의 배지로 구성된 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 200 x g에서 3분 동안 원심분리기
- 펠릿을 방해받지 않고 상등액을 조심스럽게 흡인하고 10μM의 Y-27632가 보충된 배지 1mL에 세포를 재현탁합니다.
- 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 5.2(3D 분화)로 진행합니다.
- 3D 분화에서 운동 뉴런 스페로이드(MNS)의 형성("3D 프로토콜")
메모: 분화 0-12일째부터 매일 완전한 매체 변화가 수행됩니다(그림 2).
- 5.1.7 단계의 iPS 세포를 100μL의 mTeSR Plus에 100μM의 Y-27632가 보충된 40,000 cells/well의 96 well U 바닥 플레이트로 시딩합니다.
- 다음 날, 각 웰을 100μL의 새로운 배지로 교체합니다.
- 0일 및 1일: 배양 배지를 흡인하고 10μM SB431542 및 100nM LDN-193189가 보충된 100μL의 KSR 배지(3.1.2)로 교체합니다.
- 2일차 및 3일차: 배양 배지를 흡인하고 10μM SB431542, 100nM LDN-193189, 5μM DAPT, 5μM SU5402, 1μM RA 및 1μM SAG가 보충된 100μL의 KSR 배지로 교체합니다.
- 4일차 및 5일차: 75% KSR 배지와 25% N2 배지(3.1.3)로 구성된 혼합 배지를 준비합니다. 그런 다음 배양 배지를 흡인하고 10μM SB431542, 100nM LDN-193189, 5μM DAPT, 5μM SU5402, 1μM RA 및 1μM SAG가 첨가된 100μL의 혼합 배지로 교체합니다.
- 6일차 및 7일차: 50% KSR 배지와 50% N2 배지로 구성된 혼합 배지를 준비합니다. 그런 다음 배양 배지를 흡인하고 5μM DAPT, 5μM SU5402, 1μM 레티노산 및 1μM SAG가 첨가된 100μL의 혼합 배지로 교체합니다.
- 8일차 및 9일차: 25% KSR 배지와 75% N2 배지로 구성된 혼합 배지를 준비합니다. 그런 다음 배양 배지를 흡인하고 5μM DAPT, 5μM SU5402, 1μM RA 및 1μM SAG가 보충된 100μL의 혼합 배지로 교체합니다.
- 10일차 및 11일차: 배지를 5μM DAPT, 5μM SU5402, 1μM RA 및 1μM SAG가 보충된 100μl의 N2 배지로 교체합니다.
- 12일차: MN을 조직 배양 칩으로 옮기거나(6단계) 배지를 20ng/mL 뇌 유래 신경영양인자(BDNF)가 보충된 100μL의 성숙 배지(3.1.4)로 교체합니다.
메모: MNS는 12일째부터 19일째까지 조직 배양 칩으로 전달될 수 있습니다. 전달되지 않은 스페로이드는 이전될 때까지 20ng/mL BDNF가 보충된 성숙 배지에서 96웰 U 바닥 플레이트에서 배양해야 합니다.
6. 운동 신경 오가노이드(MNO) 형성을 위한 조직 배양 칩의 준비
- 준비된 PDMS를 (2.13단계에서) 페트리 접시에 70% 에탄올에 최소 1시간 동안 담가 멸균<>
메모: 다음의 모든 단계는 생물 안전 캐비닛에서 조작해야 합니다.
- 현미경 유리(76 x 52mm)를 페트리 접시에 70% 에탄올에 담가 살균합니다.
- 현미경 유리를 건조하는 동안 PDMS 장치를 반 습식 현미경 유리에 놓고 밤새 기다렸다가 완전히 건조시킵니다. 완전히 건조되면 PDMS 장치가 유리에 부착되어야 합니다.
메모: 이 결합은 조직 채취를 위한 배양 후 현미경 유리에서 PDMS 장치를 분리할 수 있도록 영구적이지 않습니다. 산소 플라즈마에 의한 영구 결합은 PDMS와 유리 사이의 접착력을 극대화하는 데 사용할 수 있지만 칩과 조직 수집의 분해는 금지됩니다.
- 채널 입구의 한쪽 면에 액적을 만들어 PDMS 장치 및 현미경 유리의 마이크로 채널 표면을 DMEM/F12(1:40)의 30μL의 희석된 기저 멤브레인 매트릭스로 코팅한 다음 입구의 다른 쪽에서 피펫 또는 흡입 펌프로 용액을 흡입합니다(그림 3A). 기포 오염을 방지하기 위해 너무 많은 양의 용액을 흡입하지 마십시오.
- 그런 다음 PDMS 장치를 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 보조 용기(예: 페트리 접시)에서 배양합니다.
7. 운동 신경 오가노이드(MNO) 형성
- 사용 직전에 코팅 용액을 20ng/mL의 BDNF가 보충된 예열된 150μL의 숙성 배지로 교체합니다.
- 그런 다음 5.2.9 단계의 MNS를 넓은 구멍의 팁이 있는 마이크로 피펫을 사용하여 마이크로 채널의 입구에 놓습니다. MNS는 중력에 의해 장치 바닥에 자발적으로 정착할 수 있습니다. MNS를 주입할 때 너무 많은 압력을 가하지 마십시오(그림 3B).
메모: MNS가 조직 배양 칩의 구멍 측벽에 붙어 있는 경우 주입구의 다른 쪽에서 용액을 부드럽게 흡입합니다.
- 작은 저장소(예: 15mL 튜브 캡)에 멸균수를 채우고 2차 용기의 조직 배양 칩 근처에 놓아 매체 증발을 방지합니다. 그런 다음 5% CO2/37°C 인큐베이터에 넣습니다.
- 매체 변화의 경우, 배지 저장소의 중앙에서 소진된 배양 배지를 흡인합니다(그림 3C). 모든 배지와 조직을 흡인하지 마십시오.
- 신선한 성숙 배지(BDNF 포함)를 부드럽게 추가합니다. 매체는 2-3일마다 교체해야 합니다. 배양 중 어느 때라도 배양 배지를 건조하지 마십시오. 축삭돌기는 MNS에서 채널로 성장하고 2-3주 안에 자발적으로 단일 다발로 조립되어 MNO를 형성합니다. MNO는 장치에서 추가로 1개월 이상 배양할 수 있습니다.
