Cold Atmospheric Plasma Treatment를 이용한 신경줄기세포 분화 자극

Abstract

출처: Xiong, Z., et al. 시험관 내 원스텝 저온 대기 플라즈마 치료에 의한 신경 줄기세포 분화. J. Vis. 특급. (2019).

이 비디오는 저온 대기 플라즈마를 활용하여 신경 줄기 세포에서 분화를 유발하는 방법을 제시합니다. 이것은 자외선과 반응성 분자를 생성하여 신경 세포가 돌기를 생성하도록 자극하여 신경 세포 분화를 나타냅니다.

Protocol

1. 세포 배양 및 사전 분화

1. 신경줄기세포 배양 및 전분화
   1. 폴리-D-라이신 코팅된 커버슬립을 준비합니다. 멸균 커버슬립(직경 20mm)을 12웰 플레이트에 넣습니다. 다음 단계에 따라 커버 슬립의 세포 접착력을 높이기 위해 커버 유리에 폴리-D-라이신(0.1% w/v)을 물에 코팅합니다.
      참고: 각 세포주 및 응용 분야에 대해 최적의 조건을 결정해야 합니다.
      1. 커버슬립 표면을 폴리-D-라이신(0.1% w/v)으로 무균 코팅합니다. 커버슬립 표면이 균일하게 코팅될 수 있도록 부드럽게 흔듭니다.
      2. 37°C에서 하룻밤(~12시간) 배양한 후 폴리-D-라이신 용액을 제거하고 1mL의 멸균수로 표면을 3번 헹굽니다.
      3. 파종하기 최소 30분 전에 세포를 건조시킵니다.
2. 쥐 신경줄기세포 C17.2 (C17.2-NSC) 배양 및 전분화
   1. 10% 소 태아 혈청(FBS), 5% 말 혈청(HS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)의 25cm² 플라스크에서 C17.2-NSC를 ~2 - 3일 동안 37°C 및 5% CO2
   로 배양합니다.
   2. 세포가 85% 합류점에 도달하면 배지를 제거하고 PBS 1mL로 세포를 세척한 다음 플라스크에 1mL의 신선한 트립신(0.25%)을 추가합니다. 1분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 플라스크와 피펫에 1mL의 배양 배지를 위아래로 여러 번 추가하여 단일 세포 현탁액을 보장합니다.
   3. 혈구계(hemocymeter)를 사용하여 현탁액에 있는 세포의 밀도를 계산합니다. 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산하여 최종 세포 농도를 2 x 10⁴ cells/mL로 산출합니다.
   4. 12웰 플레이트의 코팅된 커버슬립에 C17.2-NSC를 ~2 x 10 웰당⁴개 셀의 밀도로 파딩합니다. 현미경으로 세포 밀도를 확인합니다.
      참고: 더 나은 결과를 얻으려면 면역형광 실험 전에 최적의 세포 밀도를 결정해야 합니다.
   5. 세포 배양기에서 37°C의 세포 배양기에서 12시간 동안 세포를 배양하여 부착할 수 있도록 합니다.
   6. 부착 후 PBS 1mL로 세포를 2x 세척하고 혈장 처리 48시간 전에 1% N2 보충제와 함께 DMEM/F12로 구성된 분화 배지로 세포를 배양합니다.
3. 1차 랫트 신경줄기세포 배양 및 전분화
   1. 코팅되지 않은 T25 플라스크에서 쥐 NSC 성장 배지에서 1차 쥐 NSC(신경 줄기 세포) 현탁액을 5 x 10⁵ 세포의 밀도로 배양합니다.
   2. 도립 현미경으로 신경구의 형성을 확인하십시오. 신경구의 형태가 구형과 투명한 다세포 복합체를 나타내는지 확인하십시오.
   3. 신경구의 직경이 3mm 이상에 도달하면 신경구 현탁액을 15mL 멸균 원심분리 튜브로 옮기고 신경구가 중력에 의해 안정되도록 합니다.
   4. 상층액을 조심스럽게 제거하여 신경 영역을 최소한의 매체 부피로 남겨둡니다.
   5. PBS 5mL로 신경구를 1x 헹구고 신경구가 중력에 의해 정착하도록 합니다. PBS의 최소 부피를 남기기 위해 상등액을 제거합니다.
   6. 적절한 부피의 분화 배지를 추가하여 세포 밀도를 밀리리터당 ~12 - 15 신경구로 조정합니다. 1차 랫드 NSC의 분화 배지는 DMEM/F12, 2% B27 및 1% FBS로 구성됩니다.
   7. 12웰 플레이트의 코팅된 각 커버슬립에 1mL의 신경구 현탁액을 시딩합니다.
      알림: 플레이트를 부드럽게 흔들어 신경 영역이 고르게 분포되도록 합니다. 이 단계는 더 나은 면역형광 결과를 위해 매우 중요합니다.
   8. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 플라즈마 처리 전 24시간 동안 사전 분화합니다.

2. 플라즈마 제트의 준비

1. 내부 직경이 2mm이고 외부 직경이 4mm인 반개방형 석영 튜브를 선택하십시오. 튜브에 직경 2mm의 고전압 와이어를 삽입합니다.
2. 고전압 와이어가 있는 석영 튜브를 5mL 주사기에 삽입하고 홀더를 사용하여 주사기 중앙 내부에 장착합니다. 석영 튜브의 밀봉된 끝과 주사기 팁 사이의 거리를 1cm로 설정합니다.
3. 1m 실리콘 고무 파이프(내경 12mm)를 주사기의 열린 끝에 연결한 다음 유량계와 가스 밸브에 차례로 연결합니다.

3. 제츠 인수

1. 그림 1과 같이 회로를 연결합니다. 전원 공급 장치의 출력 와이어를 플라즈마 제트 장치에 연결한 후 고전압 프로브의 팁을 출력 와이어에 연결하여 전압을 감지합니다. 고전압 프로브의 다른 쪽 끝을 오실로스코프에 연결하여 출력 볼륨의 정보를 기록합니다.tage. 전체 회로를 확인하고 전원 공급 장치, 오실로스코프 및 대용량tage 프로브는 모두 접지되어 있습니다.
2. 가스 라인을 확인하십시오. 가스 튜브가 플라즈마 제트 장치에 연결되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 헬륨(부피 분율, 99.999%)과 산소(부피 분율, 99.999%)의 가스 밸브를 열고 가스 흐름을 1 L : 0.01 L/min(He:O₂).
   로 설정합니다. 알림: 처음으로 전원 공급 장치를 켜기 전에 몇 분 동안 가스를 흐르게 하십시오.
3. 펄스 진폭, 주파수 및 펄스 폭을 각각 8kV, 8kHz 및 1600ns로 설정합니다. 회로를 다시 확인한 다음 출력 버튼을 켜서 플라즈마 제트를 생성합니다.
   주의 : 높은 볼륨을 만지지 마십시오.tage 전선은 언제든지 있습니다.

4. 신경줄기세포의 혈장 처리

1. 주사기의 노즐과 셀 웰 구멍 사이의 거리를 15mm.
   로 설정합니다. 알림: 거리는 12웰 플레이트가 놓인 플랫폼 바닥에서 측정됩니다.
2. 인큐베이터에서 12-well 플레이트를 꺼내고 사전 분화된 세포의 배지를 800μL의 새로운 분화 배지로 변경합니다.
3. 세포를 처리되지 않은 대조군 그룹, 60s He-and-O₂(1%) 가스 흐름 처리 그룹 및 60s 플라즈마 처리 그룹의 세 그룹으로 나눕니다.
   참고: 처리 조건에서 명백한 액체 손실이 없습니다.
4. 플라즈마 제트 아래에 12웰 플레이트를 놓고 주사기 노즐이 각 구멍의 중앙에 고정되어 있는지 확인한 다음 4.3.
   단계에서 언급한 다른 그룹에 적절한 처리를 제공합니다. 참고: 처리되지 않은 대조군은 균일한 처리 조건을 보장하기 위해 실험 절차 동안 실온에서 분화 배지에 보관되었습니다. He-and-O₂ (1%) 가스 흐름 처리 그룹은 플라즈마 생성 없이 He 및 O₂ (1%) 가스 흐름으로만 처리되었습니다. 모든 치료는 세 번에 걸쳐 수행해야 합니다.

5. 신경줄기세포 분화

1. 처리 후 원래 배양액을 제거하고 각 웰에 1mL의 새로운 분화 배지를 첨가합니다.
2. 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO2에서 6일 동안 세포를 배양합니다. 격일로 배지를 교체합니다.
3. 도립 위상차 광학 현미경(Inverted phase-contrast light microscope)에서 매일 서로 다른 그룹의 분화 상태를 확인합니다(그림 2). 최소 12개의 필드를 무작위로 선택하고 사진을 찍어 형태학적 변화를 기록합니다.

Results

그림 1: 실험 설정의 개략도. 플라즈마 제트 장치는 고전압 전원 공급 장치의 출력 와이어에 연결됩니다. 오실로스코프가 있는 고전압 프로브는 출력 전압을 감지하는 데 사용됩니다. 작동 가스가 주사기를 통해 흐르고 고전압이 켜져 있으면 플라즈마 제트가 생성되어 야외로 전파됩니다.

그림 2: C17.2-NSC 및 1차 랫드 NSC에 대한 일반 반전 위상차 광학 현미경 이미지. 이 그림은 Xiong et al.의 허락을 받아 각색한 것입니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
커버슬립	둥지	801008
폴리-D-라이신	베이오타임	P0128
DMEM 매체	하이클론	SH30022.01ᄂ	4 °C에서 보관
DMEM/F12 매체	하이클론	SH30023.01ᄂ	4 °C에서 보관
N2 보충제	지브코	17502048	-20 °C에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오
B27 보충제	지브코	17504044	-20 °C에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오
소 태아 세럼	하이클론	SH30084.03	-20 °C에서 보관하고 동결 및 해동을 반복하지 마십시오.
기증자 호스 세럼	하이클론	SH30074.03	-20 °C에서 tored, 동결 및 해동을 반복하지 마십시오.
페니실린/스트렙토마이신	하이클론	SV30010	4 °C에서 보관
트립신	하이클론	25300054	4 °C에서 보관
PBS 솔루션	하이클론	SH30256.01ᄂ	4 °C에서 보관
파라포름알데히드 4%	베이오타임	P0098	-20°C에서 보관
트리톤X-100	시그마	T8787
광학 현미경	난징 Jiangnan 소설 광학 회사	XD-202
고전압 전력 증폭기	지향 에너지	PVX-4110
DC 전원 공급 장치	스펠맨	SL1200
함수 발생기	알리전트	33521ᅡ
오실로스코프	텍트로닉스	DPO3034
고전압 프로브	텍트로닉스	P6015A는
12웰 플레이트	코 닝	3512
25cm2 플라스크	코 닝	430639
헬륨 가스
산소 가스
플라즈마 제트 노즐
CO2 인큐베이터
실리콘 파이프			12mm의 내경
쥐 신경줄기세포 C17.2(C17.2-NSC)