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1. 미디어 준비
참고: 모든 미디어를 37 °으로 워밍합니다. C 세포 배양에 사용하기 전에.
- 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 배지(500mL 준비용)
- Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium) 449mL에 50mL의 소 태아 혈청(FBS)을 추가하고 500mL 0.22μm 공극 필터 장치를 통해 여과합니다.
- 여과 후 1mL 항균제(50mg/mL)를 추가합니다. 배지를 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하거나 부분 표본을 ≤ -20°C에서 보관합니다.
- N2 배지(500mL 준비용)
- 5mL L-알라닌-L-글루타민(100x) 및 500μL 2-메르캅토에탄올(55mM)을 489.5mL DMEM: 영양 혼합물 F-12(DMEM/F-12)에 추가하고 500mL 0.22μm 공극 필터 장치를 통해 필터링합니다.
- 여과 후 1mL 항균제(50mg/mL)와 5mL N2 supplement-B를 추가합니다. 미디어를 4°C의 어두운 곳에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
- 무혈청 성장액(KSR) (500 mL 제조용)
- 75mL 무혈청 배지 보충제, 5mL L-글루타민(100x), 5mL MEM 비필수 아미노산(MEM-NEAA)(100x) 및 500μL 2-메르캅토에탄올(55mM)을 DMEM을 함유한 413.5mL 비글루타민에 추가하고 500mL 0.22μm 공극 필터 장치를 통해 여과합니다.
- 여과 후 1mL 항균제(50mg/mL)를 추가합니다. 미디어를 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
- 마우스 배아 줄기 세포 배지(500mL 준비용)
- DMEM을 함유한 413.5mL 비글루타민에 75mL 줄기세포 등급 FBS, 5mL MEM-NEAA(100x), 5mL L-글루타민(100x) 및 500μL 2-메르캅토에탄올(55mM)을 첨가하고 500mL 0.22μm 공극 필터 장치를 통해 여과합니다.
- 여과 후 1mL 항균제(50mg/mL)를 추가합니다. 배지를 4°C의 어두운 곳에서 최대 1개월 동안 보관하거나 부분 표본을 ≤-20°C에서 보관하십시오.
2. mESC 배양
- MEF 배지의 유사분열 비활성 MEF 공급 세포를 3-4 x 104 cells/cm2의 조직 배양 처리된 플레이트에 플레이트합니다. mESC를 도금하기 전에 37°C에서 상대 습도 ≥ 95%와 CO2 5%의 세포 배양 인큐베이터에 정착할 때까지 최소 12시간을 허용합니다. 즉시 사용하지 않는 경우 3일마다 MEF 미디어를 교체하십시오. 도금 후 7일 이내에 사용하지 않을 경우 MEF를 폐기하십시오.
- 마우스 백혈병 억제 인자(mLIF)(1,000 U/mL)를 포함하는 mESC 배지의 MEF 플레이트에 mESC(밀도 범위 1-4 x 10,4 cells/cm2)를 추가합니다. 37°C에서 ≥ 95%의 상대 습도와 5% CO2로 세포를 배양합니다.
- 접시가 ~ 70-80 % 합류 할 때가되거나 식민지가 접촉하기 시작하면 트립신-EDTA (0.05 % 트립신) (1 : 5-1 : 10)를 사용하여 mESC를 계대시킵니다. 이것은 일반적으로 2일마다 발생하지만 초기 도금 밀도에 따라 최대 4일 또는 5일이 걸릴 수 있습니다.
- 다능성을 유지하기 위해 mESC 배지의 MEF 피더 레이어에서 mESC를 유지합니다.
- 분화를 시작하기 전에 MEF가 없는 젤라틴 코팅 플레이트에 세포를 한 번 이상 통과시켜 MEF를 희석합니다.
- 조직 배양 처리된 접시에 Ca2+/Mg2+와 함께 인산염 완충 식염수(PBS)에 0.1% 젤라틴을 첨가하고 37°C에서 최소 1시간 동안 그대로 두어 젤라틴 코팅 플레이트를 준비합니다.플레이트 1.5-2 x 106셀/10cm 플레이트(2.7-3.6 x 104 cells/cm2)를 만들고 분화를 시작하기 전에 세포가 2일 동안 확장되도록 합니다.
3. MGE와 같은 Telencephalic Progenitors에 대한 mESC 차별화
- 분화일(DD) 0 = "부동 셀"
- 젤라틴으로 코팅된 플레이트에서 mESC가 2일 동안 성장한 후 배지를 흡인하고 Ca2+/Mg2+ 없이 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 플레이트 표면을 덮을 만큼 충분한 트립신-EDTA(0.05% 트립신)를 추가하고(일반적으로 10cm 조직 배양 접시 1개당 4mL 트립신-EDTA), 상대 습도 ≥95%, CO2 5%의 37°C에서 4분 동안 인큐베이터에 세포를 다시 넣습니다.
- 4분 후 mESC 배지로 부피의 2배를 사용하여 트립신-EDTA를 급냉합니다. 세포를 적절한 크기의 원심분리 튜브로 옮기고 200 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 5분 후 튜브를 제거하고 펠릿을 방해하지 않고 매체를 흡입합니다. BMP 억제제 LDN-193189(250nM) 및 Wnt 억제제 XAV-939(10μM)를 포함하는 1mL KSR:N2 배지(1:1)에 펠렛을 재현탁합니다.
- 혈구계(hemocyometer) 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 측정합니다. LDN-193189(250nM) 및 XAV-939(10μM)를 함유하는 KSR:N2 배지(1:1)에 75,000 cells/mL를 비부착성 조직 배양 접시에 추가하여 배아체(EB)로 세포 성장을 시작합니다. 37°C에서 ≥ 95%의 상대 습도와 5% CO2로 세포를 배양합니다.
- DD1에서 조직 배양 처리된 접시를 폴리-L-라이신(PBS에서 Ca2+/Mg2+)으로 하룻밤(O/N) ≥ 95% 상대 습도에서 37°C 또는 최소 1시간 동안 코팅하여 세포 "착륙"을 준비합니다.
- DD2에서 폴리-L-라이신을 흡인하고 플레이트를 라미닌(PBS에서 Ca2+/Mg2+로 10μg/mL) O/N, 37°C, ≥ 95%의 상대 습도로 코팅합니다.
메모: O/N이 최적이지만 2시간 정도면 충분할 수 있습니다. 다음날까지 플레이트를 사용하지 않을 경우 라미닌을 흡입하고 Ca2+/Mg2+가 없는 PBS로 대체한 다음 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.
- DD3("육지 세포")
- EB 해리를 시작하기 전에 라미닌을 흡인하고 조직 배양 후드에서 플레이트가 완전히 건조되도록 합니다. 광택이 있거나 눈에 띄게 젖어 보이는 접시를 사용하지 마십시오. 배지가 있는 EB를 15mL 튜브로 옮기고 15 x g에서 3-4분 동안 또는 EB가 펠릿화될 때까지 원심분리합니다.
- 배지를 흡입하고 DNase(2 U/mL)가 포함된 세포 분리 용액 3mL를 추가하고 37°C에서 상대 습도 ≥ 95%와 5% CO2에서 15분 동안 배양합니다. EB 해리를 돕기 위해 3분마다 튜브를 부드럽게 튕깁니다.
- EB가 더 이상 보이지 않거나 15분이 경과하면 DNase(1 U/mL)가 포함된 6mL KSR:N2(1:1)를 추가하고 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- LDN-193189(250nM), XAV-939(10μM) 및 ROCK 억제제 Y-27632(10μM)를 포함하는 KSR:N2(1:1)의 세포를 4.5-5 x 104 cells/cm2로 플레이트합니다.