Hanging Drop 방법에 의한 마우스 배아 줄기 세포로부터 신경 전구 생성

초록

출처: Hanafiah, A., et al. 마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 및 뉴런의 분화 및 특성화. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 행잉 드롭 방법에 의한 마우스 배아 줄기 세포(mESC)와 배아체(EB)의 분화를 보여줍니다. mESC를 매달린 방울에 현탁시키고 배양하면 세포가 응집하여 EB를 형성하고, EB는 레티노산(RA)이 보충된 분화 배지를 사용하여 신경 전구 세포(NPC)로 더욱 분화됩니다.

프로토콜

1. mESC 문화

1. 10cm 조직 배양 처리된 플레이트에 0.1% 젤라틴을 코팅하고 젤라틴을 흡입하기 전에 최소 15-30분 동안 젤라틴이 굳도록 합니다.
2. 사전 예열 된 mESC 배지 (15 % 소 태아 혈청 (FBS), 비 필수 아미노산, β-메르캅토 에탄올, L-글루타민, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 피루브산 나트륨, 백혈병 억제 인자 (LIF), PD0325901 (PD) 및 CHIR99021 (CH))에서 mESC를 배양하기 하루 전에 γ 방사선 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF).
3. γ 조사된 MEF가 E14 세포를 배양하기 전에 침전되어 플레이트 표면에 부착되도록 합니다.
4. 37°C 수조에서 E14 ESC를 해동하고 따뜻한 mESC 배지를 사용하여 15cm 원추형 튜브에 세포를 빠르게 옮깁니다. 200 x g에서 3분 동안 세포를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다.
5. 10mL의 mESC 배지에 세포를 재현탁하고 이전에 시딩된 γ 조사된 MEF가 포함된 배양 플레이트에 세포를 플레이트화합니다. 세포 배양을 37°C 인큐베이터에서 5% CO₂ 이하로 배양합니다.
6. 배양 계대 배양의 경우 배지를 흡입하고 멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 플레이트를 세척합니다. 플레이트 표면을 덮을 만큼 충분한 0.05% 트립신을 추가하고 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
7. 트립신을 mESC 배지와 피펫으로 중화하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 200 x g에서 세포를 3분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
8. 혈구계 또는 세포 계수기로 세포를 계수하고 10cm 배양 플레이트에 약 5.0 x 10⁵개의 세포를 파딩합니다.
9. 10mL의 mESC 배지에 세포를 재현탁하고, 젤라틴으로 코팅된 조직 배양 플레이트에 세포를 플레이트화하고, 앞서 설명한 대로 배양을 배양합니다.
   메모: 세포가 콜로니에서 분화하는 것을 방지하기 위해 2일마다 mESC를 계대분유하는 것이 좋습니다. 배지의 페놀 레드는 pH 지시약으로만 기능하며 세포 밀도에 따라 2일 이내에 황색(더 산성)으로 변할 수 있습니다. 따라서 매일 매체를 변경해야 할 수도 있습니다. γ 조사된 MEF는 몇 번의 통과 후에 결국 소멸됩니다.

2. EB, NPC 및 뉴런 분화

1. 배양 계대 배양 프로토콜을 수행하고 세포를 계수합니다.
2. 행잉 드롭 방법(0일차)
   1. 10cm 세포 배양 플레이트의 경우 20μL 분화 배지(15% FBS, 비필수 아미노산, β-메르캅토에탄올, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 피루브산 나트륨이 포함된 DMEM)에 5.0 x 10² 세포가 현탁되는 약 2.5 x 10⁴ 세포를 계수합니다. 세포를 포함하는 약 50개의 20μL 액적을 하나의 10cm 플레이트에 도금할 수 있습니다.
   2. 적절한 수의 세포를 분주한 다음 200 x g에서 3분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
   3. 20μL당 5.0 x 10²개의 세포(예: 1mL의 분화 배지에 있는^2.5 x 10 4개의 세포)의 세포 밀도에 대해 적절한 부피의 분화 배지에서 세포를 재현탁합니다.
   4. 마이크로피펫 또는 리피터 피펫을 사용하여 세포 현탁액의 20μL 방울을 조직 배양 플레이트의 뚜껑에 놓습니다. 방울이 병합되는 것을 방지하기 위해 서로 너무 가깝지 않은지 확인하십시오.
      메모: 액적은 조직 배양 처리된 부착 플레이트 또는 서스펜션 플레이트에 도금할 수 있으며, 플레이트 자체가 아닌 뚜껑에 배치됩니다. 보다 실현 가능하고 멸균된 접근 방식을 위해 부착 조직 배양 플레이트에 액적을 플레이트하고 아래 설명된 대로 서스펜션 플레이트로 옮깁니다.
   5. 플레이트에 5-10mL의 1x PBS를 채우고 조심스럽게 플레이트에 뚜껑을 다시 끼웁니다. 37 ° C 인큐베이터에서 배양을 배양하십시오 .
      메모: PBS는 액적이 마르는 것을 방지하기 위해 배양 플레이트에 추가됩니다.
3. 2일차에는 마이크로피펫을 사용하여 뚜껑에서 물방울을 채취하고 10mL의 분화 배지로 채워진 10cm 세포 배양 현탁액 플레이트에 넣습니다. 인큐베이터에서 저속으로 흔드는 오비탈 쉐이커에서 배양을 배양합니다.
4. 4일차에 EB를 수확하기 위해 세포를 수집하고 200 x g에서 3분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
   메모: EBs는 또한 후속 실험의 요구 사항에 따라 1x PBS로 세척할 수 있습니다.
5. 절차를 계속하고 신경전구세포(NPC)로 EB 분화를 유도하려면 5μM 레티노산(RA)으로 분화 배지를 준비합니다.
6. 100 x g에서 3분 동안 EB를 펠릿화하여 기존 배지를 제거하거나 기존 배지를 흡인하기 전에 EB가 가라앉도록 합니다. 배양 플레이트에 5μM RA를 함유한 분화 배지 10mL를 추가합니다.
7. 6일차에 위에서 설명한 대로 플레이트를 기울이고 배지를 피펫팅하여 배지의 절반 이상을 5μM RA를 함유한 새 배지로 교체합니다.
   메모: 배지의 절반 이상을 5일과 7일에 새로운 RA 함유 배지로 교체하는 것이 좋습니다. 페놀 빨간색 표시기를 기록하십시오. 노랗게 변하면 모든 매체를 교체하는 것이 가장 좋습니다.
8. 8일째에 세포를 모으고 200 x g에서 3분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거하여 NPC를 수확합니다.
   메모: NPC는 후속 실험의 필요에 따라 1x PBS로 세척할 수도 있습니다. 필요한 경우 NPC를 동결하고 나중에 배양 및 분석하기 위해 다시 해동할 수 있습니다. NPC를 배양해야 하는 경우, 아큐타아제는 트립신의 대안으로 사용될 수도 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신 + 0.53mM EDTA 1X	코 닝	25-052-CV
0.1% 젤라틴	시그마	G1890-100G	탈 이온수에서 준비
CHIR99021	케이맨 화학 물질	13122
DMEM을 참조하십시오.	코 닝	10-017-CM
DMEM/F12 매체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11320033
EB 버퍼	키아겐	19086
에탄올	111000200	팜코	탈이온수에 희석하는
소 태아 세럼	애틀랜타 바이오로직스	S10250
L-글루타민	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	25030024
리프	해당 사항 없음	해당 사항 없음	MEF 상등액에서 수집
MEM 비필수 아미노산	코 닝	25-025-CL
PD0325901	케이맨 화학 물질	13034
페니실린/스트렙토마이신	코 닝	30-002-CL
인산염 완충 식염수(PBS)	해당 사항 없음	해당 사항 없음	탈 이온수에서 준비
염화칼륨	P217-500지	폭스바겐
인산칼륨 monobasic 무수	0781-500지	폭스바겐
소금	BP358-10	Fisher 생물 시약
인산나트륨, 이염기성, 헵타하이드레이트	SX0715-1	밀리포어
레티노산	시그마	R2625	DMSO에서 준비
나트륨 피루브산	코 닝	25-000-cl
β-메르캅토에탄올	Fisher BioReagents	BP176-100